Amplificação interespecífica de marcadores moleculares de microssatélites em indivíduos de Amazona vinacea

Abstract

A vasta diversidade de aves trouxe consigo a visibilidade e o interesse humano que culminou no declínio dessas populações. De acordo com a Rede Nacional de Combate ao Tráfico de Animais Silvestres espécies de aves são as mais encontradas em capturas dessa prática ilegal. Para além do comércio desses animais, outros fatores extrínsecos que atuam no declínio das populações de pássaros são a caça e o desmatamento, práticas comuns no país, intrinsecamente ligadas ao isolamento, fragmentação e redução do tamanho efetivo populacional. A ordem Psittaciformes possui cerca de 17% de suas espécies endêmicas no Brasil, como o Papagaio-do-Peito-Roxo. Marcadores moleculares do tipo microssatélites são bastantes comuns em estudos de ecologia molecular. A escassez de dados de aves, principalmente de papagaios neotropicais, gera subexpressão de dados genéticos em inúmeros estudos de populações como estratégias de conservação. Para além de desenvolver microssatélites para espécies da ordem Psittaciformes, a grande dificuldade é fazer com que eles sejam úteis o suficientes para extrapolar sua própria espécie, a fim de torná-los universais, podendo auxiliar estudos de populações através de primers heterólogos. O presente trabalho teve como objetivo de buscar e testar primers heterólogos que viabilizem a avaliação da estrutura genética de papagaios-do-peito-roxo provenientes do Instituto Espaço Silvestre (IES). A equipe técnica do IES executou o processo de obtenção das amostras de sangue e identificados e alocados em freezer até a extração do DNA no Laboratório de Genética Forense (UFSC). O DNA foi extraído, e então quantificado e diluído. Os primers escolhidos foram: Aora8, AgGT08, AgGT83 , Alel04 e AaesB. Para testar os primers, 17 amostras foram utilizadas, a partir disso as PCR foram realizadas seguindo os protocolos dos artigos originais. A purificação foi feita através do protocolo EXO/SAP I e o sequenciamento foi executado pelo LAMEB (UFSC). Os dados foram analisados pelo software Chromas. Os marcadores Aora8 e Alel04 não amplificaram para nenhuma amostra, segundo o resultado do gel de agarose, e então foram descartados. Por fim, 31 amostras foram amplificadas para os marcadores AgGT08, AgGT83 e AaesB. Logo, 3 amostras foram escolhidas para o sequenciamento de DNA e nenhuma resultou em sequências viáveis. A baixa informatividade de primers heterólogos pode ser explicada pela distância evolutiva entre as espécies em questão. A utilização de marcadores moleculares pode causar diminuição nos resultados quanto a diversidade alélica, devido às variações nas sequências de regiões flanqueadoras dos marcadores entre as espécies. A diferença evolutiva entre as espécies, pode explicar a falta de afinidade também entre os marcadores escolhidos. Apesar dos esforços empregados no presente trabalho, a metodologia empregada não teve sucesso quanto a amplificação do grupo de primers heterólogos utilizados em Amazona vinacea. É importante que outros estudos se dediquem na identificação do genoma completo da espécie, a fim de que novas abordagens em relação à marcadores moleculares de microssatélites possam ser isoladas e caracterizadas.

Abstract: The vast diversity brought with it visibility and human interest that culminated in countless practices generating population decline. According to the National Network to Combat Wild Animal Trafficking, bird species are the most commonly found in captures of this illegal practice. In addition to the trade in these animals, other extrinsic factors that contribute to the decline of bird populations are hunting and deforestation, common practices in the country. The Psittaciforme order has around 17% of its species endemic to Brazil, such as the Purple-breasted Parrot. The viability of populations is intrinsically linked to isolation, fragmentation and reduction in effective population size. Microsatellite-type molecular markers are quite common in molecular ecology studies. The scarcity of bird data, especially Neotropical parrots, leads to deficits in numerous studies and conservation strategies. In addition to isolating and developing microsatellites for species of the Psittaciformes family, the great difficulty is to make them useful enough to extrapolate their own species, those that do not have a complete genome described, can study populations through heterologous primers. The present work aimed to search for and test heterologous primers that enable the evaluation of the genetic structure of purple-breasted parrots from the Instituto Espaço Silvestre (IES). The IES technical team carried out the process of obtaining the blood samples and identified them and placed them in a freezer until the DNA was extracted at the Forensic Genetics Laboratory (UFSC). DNA extraction followed an adapted protocol, and was then quantified and diluted. The primers were chosen through searches for bibliographic references. In this way, those chosen were: Aora8, AgGT08, AgGT83, Alel04 and AaesB. To test the primers, 17 extracted and diluted samples were used, after which PCRs were carried out following the protocols of the original articles. Purification was carried out using the EXO/SAP I protocol and sequencing was performed by LAMEB (UFSC). The data was analyzed using Chromas software. Initially, 17 samples were tested for the 5 primers, however for the markers Aora8 and Alel04, they did not amplify for any sample, according to the results of the agarose gel, and were then discarded. In the end, 31 samples were amplified for the markers AgGT08, AgGT83 and AaesB. Therefore, 3 samples were chosen for DNA sequencing and none resulted in viable sequences. The low informativeness of heterologous primers can be explained by the evolutionary distance between the species in question. The use of molecular markers can cause a decrease in results regarding allelic diversity, due to variations in the sequences of regions flanking the markers between species. The evolutionary difference between species may also explain the lack of affinity between the chosen markers. Despite the efforts used in the present work, the methodology used was not successful in amplifying the group of heterologous primers used in Amazona vinacea. It is important that other studies focus on identifying the complete genome of the species, so that new approaches in relation to microsatellite molecular markers can be isolated and characterized.