NanoTROP: desenvolvimento de uma nanopartícula lipídica conjugada com anticorpo para o carreamento de DNA plasmidial em câncer

Abstract

As terapias genéticas utilizando ácidos nucleicos surgiram frente à necessidade emergente de desenvolver novas abordagens para o tratamento do câncer e com o objetivo de promover modificações específicas na expressão de genes importantes às células neoplásicas, especialmente alvos moleculares para os quais não se dispõe de terapia farmacológica seletiva ou eficaz. Ácidos nucleicos, quando administrados na sua forma livre, apresentam meia-vida curta devido à extensiva degradação por DNA/RNAses expressas em sistemas biológicos. Nesse contexto, as nanoformulações surgem como uma estratégia promissora para aprimorar a entrega seletiva de ácidos nucléicos em tecidos-alvo. No presente trabalho desenvolveu-se três formulações de nanopartículas lipídicas (NPL1, NPL2 e NPL3), e avaliou-se as partículas de acordo com as suas características físico-químicas, morfológicas, eficiência de encapsulação de DNA plasmidial, potencial de citotoxicidade e hemólise, eficiência de entrega celular e estabilidade. De acordo com os dados obtidos, concluiu-se que a NPL3 é a formulação que demonstra a maior capacidade para atuar como uma plataforma de entrega celular, apresentando alta eficiência de encapsulação de plasmídeo (>90%), sendo capaz de ser captada para o meio intracelular e promovendo a expressão de proteínas GFP codificada pelo vetor plasmidial carreado. Além disso, as nanopartículas apresentaram baixa citotoxicidade em modelos de cultivo celular in vitro. Ademais, hipotetizou-se que adicionar uma estratégia de vetorização ativa à NPL3 poderia direcionar o tratamento, aumentando a eficiência de entrega celular e reduzindo efeitos adversos resultantes de uma acumulação inespecífica no organismo. Para isso, identificou-se como alvo a proteína TROP2, expressa na superfície de diversos tipos tumorais, e como ligante o anticorpo anti-TROP2, o qual foi conjugado à superfície das nanopartículas. Foi padronizada uma metodologia de conjugação de anticorpos às nanopartículas, utilizando uma reação química com EDC e sulfo-NHS, assim como uma estratégia de confirmação da conjugação e um processo de purificação da formulação, de modo a retirar os resíduos dessa reação. As formulações purificadas apresentaram baixa toxicidade em cultivos celulares in vitro e efeito hemolítico mínimo quando comparadas às nanopartículas anticorpo-conjugadas não purificadas. Em conclusão, os dados do presente trabalho comprovam o potencial da plataforma construída e evidenciam a necessidade de realizar testes adicionais para comprovar a eficiência da entrega direcionada, utilizando anticorpos.

Abstract: Gene therapies using nucleic acids have arisen in the face of the emerging need to develop new approaches to cancer treatment and with the aim of promoting specific modifications in the expression of genes important to neoplastic cells, especially molecular targets for which there is no selective or effective pharmacological therapy. Nucleic acids, when administered in their free form, have a short half-life due to extensive degradation by DNA/RNAses expressed in biological systems. In this context, nanoformulations have emerged as a promising strategy to improve the selective delivery of nucleic acids to target tissues. This study developed three lipid nanoparticle formulations (NPL1, NPL2 and NPL3) and evaluated the particles according to their physicochemical and morphological characteristics, plasmid DNA encapsulation efficiency, cytotoxicity and hemolysis potential, cell delivery efficiency and stability. According to the data obtained, it was concluded that NPL3 is the formulation that demonstrates the greatest capacity to act as a cell delivery platform, showing high plasmid encapsulation efficiency (>90%), being able to be taken up into the intracellular medium and promoting the expression of GFP proteins encoded by the plasmid vector carried. In addition, the nanoparticles showed low cytotoxicity in in vitro cell culture models. Furthermore, it was hypothesized that adding an active vectorization strategy to NPL3 could target the treatment, increasing the efficiency of cellular delivery and reducing adverse effects resulting from non-specific accumulation in the body. To this end, the TROP2 protein, expressed on the surface of various tumor types, was identified as the target and the anti-TROP2 antibody as the ligand, which was conjugated to the surface of the nanoparticles. A methodology for conjugating antibodies to the nanoparticles was standardized, using a chemical reaction with EDC and sulfo-NHS, as well as a strategy for confirming the conjugation and a process for purifying the formulation in order to remove the residues of this reaction. The purified formulations showed low toxicity in in vitro cell cultures and minimal hemolytic effect when compared to the unpurified antibody-conjugated nanoparticles. In conclusion, the data from the present work prove the potential of the platform constructed and highlight the need to carry out additional tests to prove the efficiency of targeted delivery using antibodies.