Dissecting evolutionary and molecular aspects of FLA and FLABP trypanosomatid proteins

Abstract

O tripanosomatídeo Trypanosoma brucei possui um ciclo de vida complexo, incluindo a transição das formas de corrente sanguíneas (bloodstream forms, BSFs) presentes no hospedeiro mamífero para as formas procíclicas (procyclic forms, PCFs) no vetor tsé-tsé. Durante esta transição também ocorre a troca das proteínas variantes de superfície para prociclinas. T. brucei possui um único flagelo que é lateralmente aderido ao corpo celular do parasito através da zona de adesão flagelar (FAZ). A FAZ é um complexo de citoesqueleto composto por diversos componentes, incluindo proteínas FLA e FLABP, que são localizadas na membrana do corpo celular e o flagelo, respectivamente. A depleção de FLA ou FLABP causa descolamento do flagelo, afetando a divisão celular, nado e infectividade do parasito. T. brucei possui múltiplos genes FLA e FLABP que são diferencialmente expressos, sendo FLA1/FLA1BP expressos por PCFs, e FLA2/FLA2BP específicos de BSFs. Considerando a estabilidade da estrutura da FAZ, FLA2/FLA2BP possivelmente promovem adesão flagelar durante a diferenciação de BSFs para PCFs. Portanto, esta tese teve como objetivo investigar aspectos funcionais de FLA e FLABP em T. brucei, assim como a evolução destas proteínas em outros tripanosomatídeos. A busca por genes ortólogos revelou que embora a maioria dos tripanosomatídeos possua um gene FLA e outro FLABP, T. brucei e Trypanosoma congolense possuem uma expansão destes genes. Em T. brucei, esta expansão levou a diversificação destes genes estágio-específicos, com FLA2 e FLA2BP exibindo inserções nos domínios extracelulares. Para investigar se FLA2 e FLA2BP são funcionais em formas PCFs de T. brucei, um sistema de dupla indução foi utilizado para simultaneamente induzir a depleção de FLA1 ou FLA1BP por RNAi, e a expressão de FLA2 ou FLA2BP::Ty. Após 24 horas de indução, o citoesqueleto dos parasitos foi extraído e preparado para imunofluorescências. Enquanto FLA2 foi capaz de substituir FLA1 e promover adesão flagelar, FLA2BP::Ty não substituiu FLA1BP e ficou concentrada na região da bolsa flagelar. Surpreendentemente, a expressão de FLA2 nestas células permitiu com que FLA2BP::Ty fosse localizada na FAZ, aderindo o flagelo e compensando a depleção de FLA1BP. Ademais, o alinhamento da sequência proteica de FLABPs revelou um motivo intracelular conservado entre tripanosomatídeos. Para analisar o papel deste motivo na localização de FLA1BP, o sistema duplo de indução foi utilizado para induzir FLA1BP-RNAi e expressar FLA1BP::Ty ou diferentes mutantes de FLA1BP contendo a deleção completa ou parcial do motivo conservado. Interessantemente, enquanto os parasitos expressando FLA1BP::Ty exibiram a proteína com localização flagelar, a expressão dos mutantes do domínio conservado resultou na FLA1BP localizada no lado da FAZ do corpo celular. De forma geral, estes resultados mostram que proteínas FLA e FLABP são conservadas entre tripanosomatídeos, mas sofreram expansão em T. brucei e T. congolense. No T. brucei, FLA2 e FLA2BP são capazes de promover a adesão flagelar em PCFs, mas FLA2BP necessita ligar a uma FLA2 para ser direcionada ou ancorada corretamente na membrana flagelar. Portanto, FLA2 e FLA2BP possivelmente aderem o flagelo durante a diferenciação para PCFs. Finalmente, o motivo conservado de FLABPs é potencialmente importante para a localização flagelar de FLABP.

Abstract: The trypanosomatid Trypanosoma brucei is a unicellular parasite that causes African trypanosomiasis. T. brucei has a complex life cycle, including the transition from bloodstream forms (BSFs) in the mammalian host to procyclic forms (PCFs) within the tsetse vector, during which its cell surface coat switches from variant surface glycoproteins to procyclins. T. brucei has a single flagellum that remains laterally attached to its cell body through the flagellum attachment zone (FAZ). The FAZ is a cytoskeleton complex composed of several components, including FLA and FLABP proteins, which are localised in the cell body and flagellar membranes, respectively. The depletion of either FLA or FLABP protein causes flagellar detachment, affecting cell division, motility, and infectivity. T. brucei encodes multiple FLA and FLABP genes, which are differentially expressed, with FLA1 and FLA1BP expressed in PCFs, while FLA2 and FLA2BP are BSF-specific. Given that the FAZ is a stable structure, FLA2/FLA2BP must likely be able to support flagellar attachment in a cell transitioning from BSF to PCF. Thus, this thesis aimed to investigate FLA and FLABP proteins functional requirements in T. brucei, and the evolution of these proteins among trypanosomatid species. Search for FLA and FLABP orthologs revealed that while most trypanosomatids have a single FLA and FLABP genes, T. brucei and the closely related Trypanosoma congolense have an expansion of these. In T. brucei, this expansion led to the diversification of stage-specific FLA/FLABP pairings, with FLA2 and FLA2BP containing insertions within their extracellular domains. To investigate if FLA2 and FLA2BP could operate in PCFs of T. brucei, a double-inducible system was used to simultaneously induce the depletion of FLA1 or FLA1BP by RNAi and the expression of FLA2 or FLA2BP::Ty. After 24 hours of induction, cytoskeletons were extracted and prepared for imaging. While FLA2 could replace FLA1 and maintain flagellar attachment, FLA2BP::Ty could not substitute FLA1BP. In these cells, the flagellum became detached, and FLA2BP concentrated in the flagellar pocket region. Surprisingly, FLA2 expression in these cells enabled FLA2BP::Ty to correctly localise to the FAZ and attach the flagellum, compensating for the loss of FLA1BP. Additionally, the protein sequence alignment of FLABPs revealed an intracellular motif conserved among trypanosomatids. To analyse the role of this conserved motif in FLA1BP localisation, the double-inducible system was utilised to deplete FLA1BP by RNAi and express FLA1BP::Ty and different mutants lacking the complete or partial conserved domain. Interestingly, in double-induced parasites expressing wild-type FLA1BP::Ty, the tagged protein localised to the flagellum, while FLA1BP was mislocalised to the cell body FAZ in cells expressing the conserved motif mutants. Overall, these results show that FLA/FLABP proteins are conserved among trypanosomatids but expanded in T. brucei and T. congolense. In T. brucei, the FLA2/FLA2BP pair can operate within a procyclic cell coat environment, but FLA2BP must likely bind to FLA2 to be correctly addressed or anchored to the flagellar membrane. Thus, BSF-specific FLA2 and FLA2BP proteins can likely maintain flagellar adhesion during differentiation to PCFs. Finally, the FLABP conserved motif is likely important for the FLABP flagellar localisation.