Proteína p53 mutante em câncer de mama triplo-negativo: impacto no perfil inflamatório tumoral e de macrófagos em modelos celulares in vitro

Abstract

O câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mulheres em todo o mundo, sendo o câncer de mama triplo-negativo (TNBC) um dos subtipos mais agressivos e de pior prognóstico. Diversas vias regulatórias e mutações têm sido investigadas em TNBC, a fim de se encontrar um alvo farmacológico mais específico. Dentre as mutações associadas ao TNBC, destaca-se a do gene supressor de tumor TP53, presente em cerca de 80% dos casos, sugerindo um papel importante na patogênese desses cânceres. Ademais, o TNBC tem alta presença de macrófagos associados a tumor (TAMs) no microambiente tumoral, os quais podem expressar um fenótipo tipo-M1 (pró-inflamatório) ou tipo-M2 (anti-inflamatório) e são importantes em processos tumorigênicos. Assim, avaliamos a influência da p53 mutante na expressão gênica de transcritos relacionados a inflamação, na secreção da interleucina 8 (IL-8) e na modulação do perfil fenotípico de macrófagos. Utilizamos a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231 (p53R280K) e monócitos U937 diferenciados a macrófagos utilizando o PMA a 100 nM por 48 h. Para indução dos fenótipos M1 e M2 foram utilizados, respectivamente, IFN-γ (20 ng/mL) + LPS (100 ng/mL) e IL-4 (20 ng/mL). A análise feita nos macrófagos envolveu RT-qPCR (CXCL10, IL-1β e TNF-α como marcadores M1, e CCL22, IL-10 e TGF- β1 para M2), enquanto as metodologias usadas na linhagem tumoral MDA-MB231 abrangeram RT-qPCR (CXCL2, CXCL3, IL-6, IL-8 e PD-L1/CD274) e ELISA (IL-8) para avaliação de genes e proteínas relacionados à inflamação e Western Blot para confirmação da depleção de p53. Constatou-se que o modelo de diferenciação de monócito à macrófago foi eficiente a partir das análises morfológicas e de expressão gênica, assim como a indução do perfil M1, pelo aumento de transcritos pró-inflamatórios. A indução do fenótipo M2 foi inferida pelo perfil morfológico e ausência de indução dos genes inflamatórios, entretanto, os marcadores M2 selecionados não apresentaram diferença em relação ao grupo diferenciado apenas com PMA. Observou-se que a depleção da p53 mutante reduziu a secreção de IL-8 e a expressão de PD-L1. Contudo, a análise de expressão gênica dos marcadores M1/M2 nos macrófagos U937 expostos ao meio condicionado de MDA-MB-231, não mostrou evidência de polarização M1/M2, independente da depleção ou não de p53 mutante, no protocolo estudado. O estudo contribui validando um modelo de diferenciação de U937 a macrófago e de indução de fenótipo M1 e M2, embora este último requer refinamento dos marcadores gênicos. Auxilia ainda na compreensão do papel da p53 mutante na modulação do microambiente tumoral, destacando sua influência na expressão de PD-L1 e IL-8, e dá suporte a futuros ajustes no modelo de diferenciação monócito-macrófago induzido pelo secretoma de células tumorais.

Breast cancer is the most frequent neoplasm among women worldwide, with triple-negative breast cancer (TNBC) being one of the most aggressive subtypes and having the poorest prognosis. Several regulatory pathways and mutations have been investigated in TNBC to identify more specific pharmacological targets. Among the mutations associated with TNBC, the tumor suppressor gene TP53 mutation stands out, present in approximately 80% of cases, suggesting an important role in the pathogenesis of these cancers. Moreover, TNBC exhibits a high presence of tumor-associated macrophages (TAMs) in the tumor microenvironment, which can express either an M1 (pro-inflammatory) or M2 (anti-inflammatory) phenotype and play a crucial role in tumorigenic processes. In this study, we evaluated the influence of mutant p53 on the gene expression of inflammation-related transcripts, interleukin-8 (IL-8) secretion, and modulation of macrophage phenotypic profiles. We used the MDA-MB-231 breast cancer cell line (p53R280K) and U937 monocytes differentiated into macrophages using 100 nM PMA for 48 h. To induce the M1 and M2 phenotypes, we treated U937 cells with IFN-γ (20 ng/mL) + LPS (100 ng/mL), and IL-4 (20 ng/mL), respectively. The analysis performed on macrophages involved RT-qPCR for CXCL10, IL-1β, and TNF-α as M1 markers, and CCL22, IL-10, and TGF-β1 as markers for M2. The methods used in MDA-MB231 cells included RT-qPCR for CXCL2, CXCL3, IL-6, IL-8, and PD-L1 expression, and ELISA for IL-8 quantification in the conditioned medium, and Western Blot to assess the efficiency of p53 depletion in siRNA assays. The results showed that the monocyte-to-macrophage differentiation model was effective based on cell morphology and gene expression assessments, as well as the induction of the M1 profile, as evidenced by increased pro-inflammatory transcripts’ expression. The IL4-polarized cells showed macrophage-like cell morphology, with no altered expression of the M1 or M2 markers tested herein, thereby indicating that further refinement of the M2 phenotype is needed. In MDA-MB231 cells, mutant p53 depletion reduced IL-8 protein levels in the secretome, and decreased PD-L1 gene expression. However, the gene expression analysis of M1/M2 markers in U937 macrophages exposed to the conditioned medium from MDA-MB-231 cells showed no evidence of M1/M2 polarization, regardless of mutant p53 depletion. In summary, this study establishes a monocyte-to-macrophage differentiation model, with subsequent M1 and M2 polarization in U937 cells. It also aids in understanding the role of mutant p53 in modulating the tumor microenvironment, highlighting its influence on PD-L1 and IL-8 expression. In perspective, the experiments performed herein also set the ground for future studies on the impact of oncogenes and tumor suppressors upon cancer cells secretome-induced M1/M2 macrophages in the tumor microenvironment.