Detecção da bactéria Vibrio parahaemolyticus em camarão Litopenaeus vannamei: estratégias microbiológicas e moleculares

Abstract

Ferramentas sensíveis e específicas de diagnóstico de agentes patogênicos aplicadas à aquicultura representam estratégias essenciais para a identificação da etiologia de doenças, bem como para promover a biossegurança nos cultivos, minimizando, ou mesmo evitando, grandes perdas econômicas. Mesmo não englobando apenas linhagens patogênicas, o gênero Vibrio, ubíquo nos sistemas de produção aquícola, engloba vários agentes etiológicos bacterianos, associados a uma variedade de vibrioses, podendo algumas espécies apresentar potencial zoonótico. A espécie Vibrio parahaemolyticus representa um dos principais agentes bacterianos causadores de mortalidade nos cultivos do camarão branco Litopenaeus vannamei, além de ser patogênica também aos seres humanos. O V. parahaemolyticus pode ser identificado e isolado por métodos microbiológicos clássicos, por métodos histopatológicos e por métodos moleculares. Os métodos microbiológicos clássicos têm se mostrado menos sensíveis, apresentando resultados mais tardios, quando comparados aos métodos moleculares. Assim sendo, o objetivo desse trabalho foi avaliar comparativamente métodos microbiológicos, um método molecular, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR convencional), bem como a utilização das duas estratégias em conjunto, como ferramenta para a detecção da bactéria V. parahaemolyticus no camarão marinho L. vannamei. Foram utilizados exemplares juvenis de L. vannamei desafiados experimentalmente com o V. parahaemolyticus através de injeção intramuscular, contendo um inóculo de 100μL do patógeno em uma concentração de 106 UFC.mL-1 e 108 UFC.mL-1 e, por imersão na concentração de 108 UFC.mL-1 . Para as análises microbiológicas foi utilizado o cultivo em meio Ágar Tiossulfato Citrato Sais de Bile Sacarose (TCBS). Amostras de tecidos dos camarões desafiados (brânquias e pleópodos) foram utilizadas para a co-extração do material genômico bacteriano. O material purificado e quantificado foi utilizado na padronização dos ensaios de PCR. O resultado da amplificação foi avaliado através de eletroforese em gel de agarose 2%. Com base nos resultados obtidos, a utilização das duas abordagens, microbiológica e molecular, de forma conjunta foi mais eficiente para a detecção da bactéria V. parahaemolyticus. Entretanto, foi observada menor sensibilidade na detecção do patógeno utilizando o gene tox como alvo, em comparação ao gene trh. Em vista dos resultados obtidos sugerimos a utilização das duas estratégias combinadas para a detecção e o monitoramento da presença do V. parahaemolyticus nos cultivos de L. vannamei, o principal agente etiológico da Necrose Hepatopancreática Aguda (AHPND), visando a prevenção dessa doença, a biossegurança dos cultivos, bem como a segurança alimentar e, a potencial ocorrência de gastroenterite em humanos.

Sensitive and specific diagnostic tools for the detection of pathogenic agents applied to aquaculture represent essential strategies for identifying the etiology of disease, as well as to promote biosecurity in shrimp farm, minimizing, or even avoiding, economic losses. Although non-pathogenic species can be found among the genus Vibrio, a genus largely present in aquaculture production systems, several pathogenic species are also part of it, being associated to vibriosis, and some of them displaying zoonotic potential. Vibrio parahaemolyticus is considered one of the main bacterial agents causing mortality in farming of the white shrimp Litopenaeus vannamei, besides being also pathogenic for humans. The bacterium V.parahaemolyticus can be isolated and identified through classical microbiological methods, histopathological methods, as well as molecular methods. Therefore, the aim of this study was to comparatively evaluate microbiological methods, a molecular method, the Polymerase Chain Reaction (conventional PCR), as well the use of both strategies together, as tolls for the detection of V. parahaemolyticus in L.vannamei. Juvenile specimens of L. vannamei were challenged with V. parahaemolyticus through intramuscular injection of a 100μL inoculum of the pathogen at 106 UFC.mL-1 and 108 UFC.mL-1 . A challenge was also performed through immersion in marine water at 108 UFC.mL-1 . For the microbiological analysis, bacteria growth was assayed in plates containing thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS). Challenged shrimp tissue samples (gills and pleopods) were used for the co-extraction of the bacterium genomic material. Total DNA purified and quantified samples were used for the standardization of the PCR assays. The amplified material was evaluated after electrophoresis on 2% agarose gels. Our results showed that the use of both strategies, microbiologic and molecular analyses, together was more efficient for the detection of V. parahaemolyticus. However, the detection of the pathogen using the tox gene as target revealed a lower diagnostic sensitivity in comparison to the use of trh gene. Therefore, we suggest the combined utilization of both strategies toward the detection and monitoring the presence of V. parahaemolyticus in farmed L.vanammei, the main etiological agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNH), in order to prevent the disease, contribute to the biosecurity of shrimp farming, as well as to secure food safety and avoid the occurrence of gastroenteritis in humans.