Isolamento e caracterização de Escherichia coli e genes de resistência associados a bacteriófagos em frangos de corte da avicultura brasileira

Abstract

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o patógeno causador da colibacilose, doença com manifestações localizadas ou sistêmicas. A colibacilose é uma das principais doenças que acarretam prejuízos econômicos na avicultura industrial devido à alta morbidade, mortalidade e por ser uma das principais doenças infecciosas envolvidas na condenação de carcaças de frangos. O desenvolvimento da resistência antimicrobiana é um problema crescente de preocupação mundial. Os bacteriófagos lisogênicos são vetores eficazes na aquisição e disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs). Tendo em vista o exposto, este estudo visou isolar e caracterizar Escherichia coli patogênica aviária obtidas de carcaças de frangos necropsiados em granjas avícolas do Brasil. Para tal, foram coletadas amostras de 100 lotes de frangos de corte pertencentes aos estados do Paraná (30), Santa Catarina (15), Rio Grande do Sul (15), São Paulo (10), Minas Gerais (10) e Ceará (20), entre os meses de agosto e novembro de 2021. Para cada lote, foram coletados dez swabs nasotraqueais, três fígados, três baços e três fêmures de aves já necropsiadas pela rotina de inspeção. As amostras foram submetidas a isolamento bacteriano em ágar MacConkey. Os isolados de fêmures foram submetidos à reação de PCR qualitativa para detecção de genes preditores mínimos para identificação de APEC. Foi realizado teste de sensibilidade a antimicrobianos pelo método de difusão com discos e avaliou-se a capacidade de formação de biofilme utilizando placas de microtitulação e coloração com cristal violeta, seguido de análise em espectrofotômetro. As cepas foram classificadas em não produtoras de biofilme, produtoras de biofilme fraco, moderado ou forte, com base na densidade óptica (DO) dos biofilmes bacterianos. Por meio de sequenciamento de genoma completo determinou-se a espécie dos isolados, o sorogrupo dos, presença de genes de virulência e de genes de resistência, dentre eles os genes associados a bacteriófagos. Os índices de resistência fenotípica encontrados foram 69,2% para Ácido Nalidíxico, 66,1% para Ampicilina, 9,2% para Azitromicina, 44,6 para Ceftiofur, 44,6% para Ceftriaxona, 38,4% para Enrofloxacina, 29,2% para Gentamicina, 19.95% para Lincomicina/Espectinomicina 9,2% para Nitrofurantoína, 13,8% para Norfloxacina e 44,6% para Sulfazotrim. Os isolados apresentaram genes de virulência ligados à patogenicidade das cepas APEC, incluindo genes de adesão, aquisição de ferro, resistência ao soro e toxinas. Genes de resistência a antimicrobianos contra classe de aminoglicosídeos foram detectados em 79,36% dos isolados, 74,6% apresentaram genes preditos de resistência a sulfonamidas, 63,49% tinham genes preditos de resistência contra ß-lactâmicos, e 49,2% dos isolados possuíam pelo menos um dos genes de resistência a tetraciclinas. Entre os genes detectados, 27 já foram descritos em estudos anteriores e associados a bacteriófagos. Dos isolados testados, 71,43% demonstrou a capacidade de formar biofilme, destes 57,14% foram classificados como fracos formadores. Este estudo identificou uma prevalência de 58% de Escherichia coli aviária patogênica no rebanho avícola brasileiro. As cepas também apresentaram resistência antimicrobiana significativa a antibióticos amplamente utilizados na produção animal quanto no tratamento de infecções humanas. A presença de cepas multirresistentes enfatiza a importância em adotar medidas de monitoramento e farmacovigilância para conter a disseminação dessa resistência. Os resultados deste estudo ressaltam o papel dos bacteriófagos na propagação de genes de resistência antimicrobiana na indústria avícola, destacando a necessidade de estudos antimicrobianos que considerem não apenas as bactérias em si, mas também suas interações com bacteriófagos.

Abstract: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is the pathogen responsible for colibacillosis, a disease with localized or systemic manifestations. Colibacillosis is one of the main diseases causing economic losses in the poultry industry due to high morbidity, mortality, and its involvement in the condemnation of chicken carcasses. The development of antimicrobial resistance is a growing global concern. Lysogenic bacteriophages are effective vectors in acquiring and disseminating antibiotic resistance genes (ARGs). This study aimed to isolate and characterize avian pathogenic Escherichia coli obtained from necropsied chicken carcasses in poultry farms in Brazil. Samples were collected from 100 batches of broiler chickens from the states of Paraná (30), Santa Catarina (15), Rio Grande do Sul (15), São Paulo (10), Minas Gerais (10), and Ceará (20), between August and November 2021. For each batch, ten nasotracheal swabs, three livers, three spleens, and three femurs from necropsied birds during routine inspection were collected. The samples were subjected to bacterial isolation on MacConkey agar. Femur isolates underwent qualitative PCR to detect minimal predictive genes for APEC identification. Antimicrobial sensitivity tests were performed using disc diffusion, and biofilm-forming capacity was assessed with microtiter plates and crystal violet staining, followed by spectrophotometric analysis. Complete genome sequencing determined the species of isolates, serogroups, presence of virulence genes, and resistance genes, including those associated with bacteriophages. The phenotypic resistance indices found were 69.2% for Nalidixic Acid, 66.1% for Ampicillin, 9.2% for Azithromycin, 44.6% for Ceftiofur, 44.6% for Ceftriaxone, 38.4% for Enrofloxacin, 29.2% for Gentamicin, 19.95% for Lincomycin/Espectinomycin, 9.2% for Nitrofurantoin, 13.8% for Norfloxacin, and 44.6% for Sulfamethoxazole. The isolates carried virulence genes associated with APEC pathogenicity, including adhesion, iron acquisition, serum resistance, and toxins. Antibiotic resistance genes against the aminoglycoside class were detected in 79.36% of the isolates, 74.6% presented predicted sulfonamide resistance genes, 63.49% had predicted ß-lactam resistance genes, and 49.2% of isolates possessed at least one tetracycline resistance gene. Among the detected genes, 27 were previously described in studies related to bacteriophages. Out of the tested isolates, 71.43% demonstrated biofilm-forming ability, with 57.14% classified as weak formers. This study identified a 58% prevalence of pathogenic avian Escherichia coli in the Brazilian poultry population. The strains also exhibited significant antimicrobial resistance to antibiotics widely used in animal production and human infection treatment. The presence of multidrug-resistant strains emphasizes the importance of adopting monitoring and pharmacovigilance measures to curb the spread of this resistance. The results underscore the role of bacteriophages in propagating antimicrobial resistance genes in the poultry industry, highlighting the need for antimicrobial studies that consider not only bacteria but also their interactions with bacteriophages.