O ácido oleico inibe a ferroptose induzida por sobrecarga de ferro em Caenorhabditis elegans de maneira dependente de NHR-49

Abstract

O ferro é um elemento químico essencial para a manutenção da vida, mas seu excesso causa toxicidade. Este elemento possui papel central na ferroptose, uma forma de morte celular caracterizada pela peroxidação massiva de lipídios. A sobrecarga de ferro é uma síndrome caracterizada pelo seu excesso no organismo, a qual tem etiologias genéticas e/ou ambientais e causa problemas hepáticos, cardíacos e neuronais. De um ponto de vista clínico e terapêutico, o entendimento acerca dos transtornos que modulam a toxicidade do ferro em indivíduos com sobrecarga de ferro é de extrema importância. Os radicais hidroxila (?OH) e lipoperoxila (LOO?) representam oxidantes com alta reatividade e possuem papéis centrais na citotoxicidade mediada pelo ferro. Entretanto, ainda não há evidência de uma relação direta entre os danos orgânicos induzidos pela sobrecarga de ferro e ferroptose, um tipo de morte celular regulada dependente de ferro e caracterizada pela peroxidação de lipídeos. Evidências experimentais indicam que este tipo de morte celular desempenha um papel importante na progressão de condições patológicas. Curiosamente, agentes quelantes de ferro, que têm sido úteis no tratamento de indivíduos com sobrecarga de ferro, também demonstraram efeitos benéficos em modelos de ferroptose. O início e a execução da ferroptose estão intimamente ligados ao metabolismo lipídico. Neste contexto, uma enzima acil-coenzima A (CoA) sintetase 4 (ACSL4), que promove a incorporação de gorduras poliinsaturadas (PUFA) nas membranas, é necessária para a morte celular ferroptótica em vários contextos. Por outro lado, a enzima ACSL3 promove a incorporação de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) nas membranas, prevenindo a ferroptose. Ainda, a isoforma alfa (?) dos receptores ativados por proliferador de peroxissoma, conhecida como PPAR (do inglês peroxisome proliferator-activated receptor - PPAR-?) representa um elemento-chave mediando a regulação positiva de genes/proteínas envolvidos na beta-oxidação de ácidos graxos, sugerindo que os PPARs podem estar envolvidos na regulação da ferrotose. Esta hipótese é baseada no fato de que o estímulo da lipólise tem sido relatado como um evento que inibe a ferroptose. De forma interessante, o ácido oleico, um MUFA, inibe a ferroptose (ao menos em condições in vitro em cultivos celulares) por impedir a incorporação de PUFAs. Estas evidências acima mencionadas reforçam a ideia de que o metabolismo lipídico tem grande papel na regulação da ferroptose. Há evidências de que o envelhecimento (mesmo que saudável) desencadeia o acúmulo de ferro em várias regiões aéreas e tipos de células. Curiosamente, evidências crescentes apontam para o envolvimento da deposição de ferro relacionado a muitas doenças neurodegenerativas; a ferroptose pode ser um novo mecanismo subjacente à neurodegeneração. De particular importância para este projeto, a perda progressiva de neurônios dopaminérgicos parece ser particularmente sustentada pelo ferro. Objetivos Nosso objetivo geral foi investigar a ocorrência de ferroptose em C. elegans manifestada à sobrecarga de ferro, buscando (i) identificar a contribuição deste tipo de morte celular para o dano induzido pela sobrecarga de ferro e (ii) identificar estratégias protegidas para mitigar tal dano com foco em consumir gorduras com propriedades antiferroptóticas, (iii) investigar alterações no sistema dopaminérgico em C Elegans expostos a sobrecarga de ferro e os possíveis efeitos neuroprotetores do ácido oleico. Com base nas evidências acima mencionadas, sugerindo uma possível relação entre a sobrecarga de ferro e o desenvolvimento de ferroptose, a neurodegeneração como uma consequência da ferroptose e o potencial efeito antiferroptótico do MUFA ácido oleico, este trabalho de tese teve como objetivos específicos desenvolver um modelo in vivo de sobrecarga de ferro baseado no organismo modelo C. elegans e caracterizado pela exposição ao ferro exógeno (exposição ao citrato de amônio férrico - FAC) a fim de examinar a possível ocorrência de ferroptose. Ainda se pretende explorar o impacto do ácido oleico na ferroptose induzida por sobrecarga de ferro C. elegans e caracterizar os interruptores mediadores de tais efeitos. A neurodegeneração tem sido associada ao acúmulo de ferro no encéfalo e, mais recentemente, à ferroptose. Assim, nosso último objetivo foi estudar o sistema dopaminérgico no modelo de sobrecarga de ferro, investigando o possível papel protetor do ácido oleico neste modelo. Metodologia Investigou-se a própria sobrecarga de ferro seria capaz de induzir ferroptose em um modelo in vivo usando o nematóide C. elegans. Neste estudo, foram examinadas diferentes concentrações de FAC na sobrevivência do nematóide. Isso foi realizado em um curto prazo (4 dias). Após a conclusão de curvas de sobrevivências e determinadas as condições tempo e concentração, buscou-se avaliar os fenótipos relacionados à ferroptose. Para isso, foram analisados ??os níveis de GSH e a peroxidação lipídica. Os níveis de GSH totais foram medidos através do método enzimático baseado na reação de grupos tióis com o reagente de Ellman (DTNB). Para a peroxidação lipídica, os animais foram marcados com o fluoróforo marcador de peroxidação lipídica BODIPY 581/591 C11 e a fluorescência foi transmitida através da microscopia confocal. Para confirmar se o modelo estava relacionado com a ferroptose, fez-se o co-tratamento com ferro e o antioxidante lipofílico, ferrostatina-1 (inibidor clássico de ferropose). Para investigar se a suplementação com ácidos graxos modula a ferroptose, avaliou-se o efeito do co-tratamento com ferro e diferentes ácidos graxos (oleico, esteárico e linoleico). Foi demonstrado recentemente que NHR-49, o qual é um homólogo funcional do PPAR-? de mamíferos, regula expressamente a expressão de genes envolvidos na ?-oxidação de suplementos alimentares, bem como na dessaturação e alongamento lipídico para preservar a homeostase lipídica. Mas, se o NHR-49 está envolvido no efeito antiferroptótico do ácido oleico em C. elegans, manifesta uma sobrecarga de ferro desconhecida. Em busca de interromper moleculares comuns mediando os efeitos do ácido oleico, nosso próximo passo foi testar o impacto da inativação do NHR-49 na sobrevivência dos nematoides, após a sobrecarga de ferro e o co-tratamento com ácido oleico, para isso usamos a cepa VC870 nhr-49(gk405). Para abordar ainda mais o papel da ferroptose na sobrecarga de ferro, avaliamos o efeito do FAC e a exposição ao ácido oleico sobre o sistema dopaminérgico, por meio da cepa BY250 (vtIs7 [P dat-1::GFP]), que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) fusionada com o transportador de dopamina (DAT), um marcador de neurônios dopaminérgicos. Tal análise foi realizada em 72h e 96h após uma exposição ao FAC, através da técnica de microscopia confocal. Resultados e Discussão O ferro pode contribuir para o pool de espécies reativas de oxigênio na célula, por exemplo, ele catalisa a emissão de H2O2 para produzir radicais hidroxila. Posteriormente, esses radicais livres podem provocar danos celulares, peroxidação lipídica e eventualmente morte celular. A ferroptose é um tipo de morte celular regulada dependente de ferro que envolve acúmulo de ferro e peroxidação lipídica. Portanto, para investigar se a sobrecarga de ferro causa ferroptose, C. elegans foi tratado com FAC, e ferroptose foi avaliado medindo os níveis de GSH, a peroxidação lipídica e medidas dos efeitos da ferrostatina-1. Consistente com a ferroptose induzida pela sobrecarga de ferro, descobrimos que a exposição aguda ao FAC causa mortalidade nos nematóides, que foi precedida por peroxidação lipídica e depleção de GSH. Esses eventos foram prevenidos por agentes antiferroptóticos (ferrostatina-1 e BHT). Assim, nossos resultados iniciais indicam que a sobrecarga de ferro aumentou a mortalidade de C. elegans em um mecanismo dependente de ferroptose. Descobertas recentes demonstraram que os MUFAs podem efetivamente inibir a ferroptose, substituindo os PUFAs nas membranas lipídicas e enfrentando o aumento de produtos da peroxidação lipídica. Nossos ensaios revelaram que a adição de ácido oleico, protegeu contra danos mediados pela sobrecarga de ferro/ferroptose. Esses resultados, uma vez extrapolados para condições mais complexas, apontam para a possibilidade do uso de estratégias terapêuticas/nutricionais ingeridas no ácido oleico para inibir a ferroptose. Porém, o efeito protetor do ácido oleico contra a mortalidade induzida por sobrecarga de ferro, observado em vermes do tipo selvagem, foi atenuado em vermes sem NHR-49. Esses resultados sugerem que o NHR-49 em C. elegans pode estar envolvido nos efeitos protetores do ácido oleico contra a ferroptose. Além disso, investigou-se a relação da ferroptose na neurodegeneração dopaminérgica induzida por sobrecarga de ferro em C. elegans. Observe que a exposição ao FAC foi capaz de causar neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos e ácido oleico ou ferrostatina-1 protegem contra tal efeito. Estes resultados indicam que a ferroptose decorrente da sobrecarga de ferro causa neurodegeneração dopaminérgica em C. elegans e o ácido oleico protege devido a uma ação antiferroptótica.

Abstract: Introduction Iron is an essential element for life, but its excess causes toxicity. This element plays a central role in ferroptosis, a form of cell death characterized by massive lipid peroxidation. Iron overload is a syndrome characterized by iron excess in the body, which has genetic and/or environmental etiologies and causes liver, heart and neuronal damage. From clinical and therapeutic points of view, understanding the mechanisms that modulate iron toxicity in individuals with iron overload is extremely important. Hydroxyl (?OH) and lipoperoxyl (LOO?) radicals represent highly reactive oxidants for biomolecules and play central roles in ironmediated cytotoxicity. However, there is still no evidence of a direct relationship between organ damage induced by iron overload and ferroptosis, a type of irondependent regulated cell death characterized by lipidperoxidation. Experimental evidence indicates that this type of cell death plays an important role in the progression of pathological conditions.Interestingly, iron chelating agents, which have been useful in treating individuals with iron overload, have also shown beneficial effects in models of ferroptosis. The onset and execution of ferroptosis are closely linked to lipid metabolism. In this regard, the enzyme acylcoenzyme A (CoA) synthetase 4 (ACSL4), which promotes the incorporation of polyunsaturated fatty acids (PUFA) into membranes, is required for ferroptotic cell death in several contexts. In contrast, the ACSL3 enzyme promotes the incorporation of monounsaturated fatty acids (MUFA) into membranes, preventing ferroptosis. Furthermore, peroxisome proliferator activated receptor alpha (??) isoform, known as PPAR (PPAR??) represents a key element mediating the upregulation of genes/proteins involved in betaoxidation of fatty acids, suggesting that PPARs may be involved in the regulation of ferrotosis. This hypothesis is based on the fact that stimulation of lipolysis has been reported as an event that inhibits ferroptosis. Interestingly, oleic acid, a MUFA, inhibits ferroptosis (at least under in vitro conditions in cell cultures) by preventing the uptake of PUFAs. These aforementioned evidences reinforce the idea that lipid metabolism plays a major role in the regulation of ferroptosis. There is evidence that aging (even healthy aging) triggers an accumulation of iron in many organisms, including some regions of humans. Interestingly, increasing evidence points to the involvement of iron deposition in the mechanisms underlying many neurodegenerative diseases; ferroptosis may be a new mechanism underlying neurodegeneration. Of particular importance to this project, the progressive loss of dopaminergic neurons appears to be particularly affected by iron. Objectives Our general objective was to investigate the occurrence of ferroptosis in C. elegans subjected to iron overload, seeking (i) to identify the contribution of this type of cell death to the damage induced by iron overload and (ii) to identify protective strategies to mitigate such damage. focusing on fatty acids with antiferroptotic properties, (iii) investigate changes in the dopaminergic system in C. elegans exposed to iron overload and the possible neuroprotective effects of oleic acid. Based on the abovementioned evidence suggesting a possible relationship between iron overload and the development of ferroptosis, neurodegeneration as a consequence of ferroptosis and the potential antiferroptotic effect of the MUFA oleic acid, this thesis work aimed to develop an in vivo model of iron overload based on the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) and characterized by exposure to exogenous iron (FAC) in order to examine the possible occurrence of ferroptosis. An additional objective was to explore the impact of oleic acid on ferroptosis induced by C. elegans iron overload and to characterize the mediating mechanisms of such effects. Finally, we aimed to study dopaminergic neurodegeneration in the iron overload model, investigating the possible protective role of oleic acid in this model. Methodology Initially, it was investigated whether iron overload itself (exposure to ferric ammonium citrate FAC) would be able to induce ferroptosis in an in vivo model using the nematode C. elegans. In this study, the toxicities of different concentrations of FAC on the nematode were examined. This was performed on a shortterm profile (4 days). After carrying out survival curves and defining the time and concentration conditions, we sought to evaluate the phenotypes related to ferroptosis. For this, GSH depletion and lipid peroxidation were analyzed. Total GSH levels were measured using the enzymatic method based on the reaction of thiol groups with Ellman's reagent (DTNB). For lipid peroxidation, the animals were marked with the lipid peroxidation marker fluorophore BODIPY 581/591 C11 and fluorescence was analyzed by confocal microscopy. To confirm whether the model was related to ferroptosis, cotreatment with iron and the lipophilic antioxidant, ferrostatin1 (classic ferroposis inhibitor) was performed. To investigate whether supplementation with fatty acids modulates ferroptosis, the effect of cotreatment with iron and different fatty acids (oleic, stearic and linoleic) was evaluated. Nematode survival was evaluated to also test the effects of oleic acid against iron overload mediated damage in knockout worms for NHR49, which is a functional homolog of mammalian PPAR ??. The effect of iron overload and oleic acid exposure on dopaminergic neurodegeneration was evaluated in BY250 Pdat1::GFP worms, which express green fluorescent protein (GFP) fused with the dopamine transporter (DAT), a marker of dopaminergic neurons. This analysis was performed at 72h and 96h after exposure to FAC, using the confocal microscopy technique. Results and discussion Iron can contribute to the pool of reactive oxygen species in the cell, for example, it catalyses the breakdown of H2O2 to produce hydroxyl radicals. Subsequently, these free radicals can cause cell damage, lipid peroxidation and eventually cell death. Ferroptosis is a type of irondependent regulated cell death that involves iron accumulation and lipid peroxidation. Therefore, to investigate whether iron overload causes ferroptosis, C. elegans were treated with FAC, and ferroptosis was assessed by measuring GSH levels, lipid peroxidation, and measures of the effects of ferrostatin1. Consistent with iron overloadinduced ferroptosis, we found that acute exposure to FAC caused nematode mortality, which was preceded by lipid peroxidation and GSH depletion. These events were prevented by antiferroptotic agents (ferrostatin1 and BHT).Thus, our initial results indicate that iron overload increased C. elegans mortality in a ferroptosisdependent mechanism. We also observed that oleic acid protected against damage mediated by iron overload/ferroptosis. These results, once extrapolated to more complex conditions, point to the possibility of using therapeutic/nutritional strategies based on oleic acid to inhibit ferroptosis. However, the protective effect of oleic acid against iron overloadinduced mortality, observed in wildtype worms, was attenuated in worms lacking the NHR49 nuclear receptor. These results suggest that NHR49 in C. elegans may be involved in the protective effects of oleic acid against ferroptosis. Furthermore, the relationship between ferroptosis and dopaminergic neurodegeneration induced by iron overload in C. elegans was investigated. It was observed that exposure to FAC was able to cause neurodegeneration of dopaminergic neurons and oleic acid or ferrostatin1 protected against this effect. These results indicate that ferroptosis due to iron overload causes dopaminergic neurodegeneration in C. elegans and oleic acid protects due to its antiferroptotic action.