Transcrição de genes de defesa e microbioma intestinal no camarão marinho, Litopenaeus vannamei, frente ao vírus da mancha branca em sistema de bioflocos e água clara

Abstract

A produção de camarão em sistema com bioflocos (BFT) mostra-se como uma alternativa sustentável e economicamente viável. Impulsionado pela ocorrência de enfermidades virais na carcinicultura, o emprego deste sistema de cultivo, considerado como mais biosseguro, está presente em diversos países produtores, inclusive no Brasil. Entre seus aspectos positivos estão a reciclagem da água, reuso contínuo de nutrientes, diminuição do impacto ambiental e fonte adicional de alimento. Neste estudo foram avaliadas algumas respostas moleculares de defesa no camarão branco do Pacífico, Litopenaeus vannamei, mantido em BFT, após desafio experimental com o vírus da síndrome da mancha branca, WSSV. Paralelamente, foi investigado o possível efeito da infecção viral sobre o perfil da microbiota intestinal dos camarões e sua relação com a microbiota aquática do sistema de cultivo. Espécimes juvenis (n=168) foram aclimatados por 15 dias, sendo 84 camarões mantidos em tanque com água clara (ACT), em um volume de 500 L, com renovação contínua, e 84 em tanque com BFT maduro, com capacidade para 1000 L, com troca zero de água. Após aclimatação, os camarões de ambos os sistemas foram individualmente desafiados com o WSSV, por meio de um inóculo contendo uma carga viral média (5,3 x 104 vírus.ml/camarão), enquanto outros foram injetados com solução salina estéril (grupo controle). Hepatopâncreas, intestino, brânquias e hemócitos foram coletados na pré-infecção e 48h pós-infecção. A quantificação do número de transcritos dos genes alvo foi realizada através de PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR). O número de transcritos dos genes QM e Ran, envolvidos diretamente com as respostas celulares de defesa, foi significativamente maior (p<0,05) nos camarões infectados com WSSV, em comparação aos não infectados. Em particular, o aumento de transcritos de QM foi relacionado à infecção pelo WSSV, independentemente do tecido ou do sistema de cultivo. Com base nos genes alvo analisados, em 48h pós-infecção, o hepatopâncreas foi considerado o tecido mais responsivo quanto ao perfil de transcritos. Embora tenhamos observado maior mortalidade entre os camarões mantidos em BFT, em relação àqueles mantidos em ACT, os níveis de transcritos foram semelhantes entre os camarões não infectados, mantidos nesses dois sistemas. A caracterização do perfil da microbiota intestinal dos camarões, assim como da microbiota da água, frente à infecção com o WSSV, foi baseada na amplificação de sequências alvo de regiões hipervariáveis do gene 16S rRNA, seguida da análise de sequenciamento de nova geração, NGS (Next Generation Sequencing). O WSSV foi capaz de interferir no equilíbrio do microbioma intestinal de L.vannmei, sendo este efeito mais evidente nos camarões mantidos em ACT. Após a infecção viral, houve prevalência de Cetobacterium spp, independentemente do sistema (BFT ou ACT) e queda significativa (p<0,05) de Bacillus spp nos animais mantidos em ACT. Não foi observada relação entre a microbiota intestinal e a microbiota da água, nos níveis de Filo e Gênero. Observamos que, apesar de biosseguro, com a introdução do WSSV no BFT, a mortalidade dos camarões ocorreu em um intervalo de tempo mais curto, tendo sido mais elevada, em relação ao sistema ACT. Nossos resultados respaldam e reforçam a relevância da caracterização do perfil diferencial de transcritos de genes do hospedeiro mobilizados frente à infecção pelo WSSV, assim como evidenciam a interferência da infecção viral na microbiota intestinal de L. vannamei e a relevância das características inerentes a cada sistema de cultivo.

Abstract : Shrimp farming with biofloc is viewed as a sustainable and economically viable alternative of production. Due to the impact of viral diseases in shrimp farming, biofloc technology (BFT) can contribute to biosecurity and is already present in many countries, including Brazil. It relies on continuous recycling of water and reuse of nutrients, besides minimizing environmental impact and serving as additional food source. In the present study, some molecular defense responses were evaluated in juvenile shrimp Litopenaeus vannamei kept in BFT, after challenge with White Spot Syndrome Virus (WSSV). A putative effect of viral infection on the intestine microbiota of these shrimp was investigated, along with its relation to the aquatic microbiota present in the cultivation system. Shrimps (n=168) were acclimated for 15 days, 84 individuals in a tank with 5000 L of clear sea water (CSW), with water being continuously renewed, whereas other 84 in a 1000L tank with BFT, with zero water exchange. After acclimation, shrimp were either individually challenged with WSSV, using an inoculum with a medium virus load (5.3 x 104 virus.ml/shrimp), or injected with sterile saline solution. Hepatopancreas, intestine, gills and hemocytes were sampled before (preinfection) and 48h post-infection. The number of transcripts for target genes was determined using quantitative Real Time PCR (qRT- PCR). QM and Ran, genes directly involved in cellular defense response, were up-regulated (p<0.05) in WSSV infected shrimp. Noteworthy, levels of QM transcripts could be directly related to viral infection, depending neither of tissue nor cultivation system. Overall, hepatopancreas showed to be the most responsive tissue at 48 h post- infection. Although shrimp mortality was higher in BFT in comparison to CSW, levels of transcripts were similar in non-infected shrimp in both systems. The characterization of shrimp intestinal microbiota, as well as that of water, upon WSSV challenge, was based on the amplicons from hypervariable regions within the 16S rRNA gene, followed by Next Generation Sequencing (NGS). WSSV was able to interfere in the equilibrium of L.vannamei intestinal microbiota, particularly in shrimp kept in CSW. Upon viral infection, Cetobacterium spp prevailed in both, BFT and ACT, whereas Bacillus spp diminished in CSW (p<0.05). Moreover, we observed no relation between intestinal and water microbiota. We point out that once WSSV became present in BFT, shrimp mortality was not only higher but was seen earlier in comparison to CSW. Therefore, the relevance of addressing differential transcript levels of shrimp genes recruited upon viral infection is further supported with our findings. Moreover, we showed that WSSV affects L.vannmei intestinal microbiota and also that the characteristics of each cultivation system are relevant.