Desenvolvimento de nanocarreadores contendo ácido all-trans retinóico para administração oral e avaliação da atividade antitumoral em modelo de melanoma murino B16F10

Abstract

O ácido all-trans retinóico (ATRA) é um derivado da vitamina A com potente atividade antitumoral, que possui como efeito biológico a regulação da diferenciação e proliferação celular, sendo considerado o fármaco de primeira escolha no tratamento de leucemia pró-mielocítica aguda. Estudos in vitro e in vivo evidenciaram que o ATRA apresenta atividade antitumoral frente ao melanoma metastático. Entretanto, o ATRA apresenta baixa solubilidade em meio aquoso, limitando sua administração por via oral e necessitando de doses elevadas para a obtenção de efeitos farmacológicos. Para contornar esse problema, o desenvolvimento de nanocarreadores contendo o ATRA foi proposto neste trabalho. Previamente, a solubilidade do ATRA em diferentes óleos foi avaliada e o óleo de rícino foi selecionado devido a sua maior capacidade de solubilizar o fármaco. Nanoemulsões e nanocápsulas poliméricas brancas e contendo ATRA foram desenvolvidas usando a técnica de emulsificação espontânea e deposição interfacial do polímero pré-formado, respectivamente. A lecitina de soja foi empregada como surfactante lipofílico e Poloxamer 188 e Tween® 80 como surfactantes hidrofílicos. Para a obtenção das nanocápsulas, dois polímeros gastroresistentes, o Eudragit® S100 e o acetato ftalato de celulose, foram testados. As formulações foram avaliadas quanto as suas características de tamanho e índice de polidispersão, potencial zeta, pH, teor e eficiência de encapsulação do ATRA. Um método analítico de cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido e validado para quantificação do ATRA nas formulações. O método analítico mostrou ser específico, linear, preciso, exato e robusto. Suspensões coloidais de nanoemulsões e nanocápsulas monodispersas e com tamanho de cerca de 200 nm e potencial zeta negativo foram obtidas. O teor de ATRA nas formulações foi de cerca de 900 ?g/mL e a eficiência de encapsulação foi maior que 99%, indicando que o ATRA se encontra preferencialmente associado às gotículas/partículas. Os estudos de estabilidade indicaram que as formulações são estáveis durante 60 dias, e que a encapsulação foi capaz de proteger o fármaco da rápida degradação. O perfil de liberação do ATRA a partir dos diferentes nanocarreadores foi avaliado pelo método do saco de diálise e após incubação direta das formulações nos meios de liberação gástrico e intestinal simulados. Os perfis de liberação mostraram um baixo percentual do ATRA liberado após 24 h (< 10%), tanto para o ATRA livre como encapsulado, quando o método o do saco de diálise foi empregado. Uma maior liberação do ATRA foi verificada para a nanoemulsão após 6 h de incubação direta da formulação em meio intestinal simulado, mostrando a maior capacidade deste sistema em liberar o fármaco. A atividade citotóxica in vitro foi avaliada pelo ensaio do MTT em células de melanoma murino B16F10. Os resultados mostraram uma redução significativa da viabilidade celular após tratamento com os nanocarreadores, quando comparado ao fármaco livre (p < 0,05). Estudos preliminares de atividade antitumoral in vivo foram realizados em modelo de melanoma murino após inoculação das células B16F10 no dorso de camundongos C57BL/6, seguido do tratamento oral com ATRA livre e nanoencapsulado, na dose de 10 mg/kg. Entretanto, nas condições testadas não foi observado redução no volume do tumor entre os grupos tratados, indicando que estudos devem ainda ser realizados para otimização das condições do ensaio de atividade antitumoral.

Abstract: All-trans retinoic acid (ATRA) is a vitamin A derivative with potent antitumor activity, which has the biological effect of regulating cell differentiation and proliferation, being considered the drug of first choice in the treatment of acute promyelocytic leukemia. In vitro and in vivo studies have evidenced the antitumor activity of ATRA against metastatic melanoma. However, ATRA exhibits low water solubility, limiting its oral administration and requiring high doses to obtain pharmacological effects. Thus, in this study, the development of nanocarriers containing ATRA was proposed to overcome this drawback. Previously, the solubility of ATRA in different oils was evaluated, and castor oil was selected due to its greater ability to solubilize the drug. Unloaded and ATRA-loaded nanoemulsions and polymeric nanocapsules were developed using the spontaneous emulsification and the interfacial deposition of the preformed polymer method, respectively. Soy lecithin was used as lipophilic surfactant, and Poloxamer 188 and Tween® 80 as hydrophilic surfactants. Two gastro-resistant polymers, Eudragit® S100 and cellulose acetate phthalate, were tested to obtain nanocapsules. The formulations were evaluated according to size and polydispersity index, zeta potential, pH, drug content, and encapsulation efficiency. A high-performance liquid chromatography analytical method was developed and validated to quantify ATRA in the formulations. The analytical method was specific, linear, precise, accurate, and robust. Monodisperse colloidal dispersions of nanoemulsions and nanocapsules with a mean size of about 200 nm and negative zeta potential values were obtained. The ATRA content in the formulations was about 900 ?g/mL, and the encapsulation efficiency was higher than 99%, indicating the drug is preferentially associated with the nanodroplets/nanoparticles. Stability studies indicated that the formulations were stable for 60 days and that nanoencapsulation could protect the drug from rapid degradation. The ATRA release profile from the different nanocarriers was evaluated by the dialysis bag method and after direct incubation of the formulations in simulated gastric and intestinal release media. The release profiles showed a low percentage of ATRA released after 24 h (< 10%) for free and encapsulated ATRA when the dialysis bag method was employed. A greater release of ATRA was verified for the nanoemulsion after 6 h of direct incubation of the formulation in a simulated intestinal medium, showing the greater capacity of this system to release the drug. In vitro cytotoxic activity was evaluated using the MTT method on B16F10 murine melanoma cells. The results showed a significant reduction in cell viability after treatment of the cells with the ATRA-loaded nanocarriers compared to the free drug (p < 0.05). Preliminary in vivo antitumor activity studies were performed in a murine melanoma model after inoculation of B16F10 cells on the back of C57BL/6 mice, followed by the oral treatment with the free drug and ATRA-loaded nanocarriers at a dose of 10 mg/kg. However, under the conditions tested, no reduction in tumor volume was observed between the treated groups, indicating that studies must still be carried out to optimize the conditions of the antitumor activity assay.