Monitoramento da viabilidade celular da bactéria promotora de crescimento vegetal Azospirillum brasilense FP2 em raízes de milho in vitro usando PMA-qPCR

Abstract

Azospirillum brasilense é uma bactéria promotora de crescimento vegetal (BPCV) atualmente utilizada como inoculante em diversas culturas. Uma vez que a condição essencial para que ocorra o estímulo efetivo do crescimento vegetal por BPCV é a sua capacidade de sobreviver na rizosfera, são necessários métodos analíticos precisos para identificar e monitorar as células viáveis presentes em formulações de inoculantes ou nas plantas. O objetivo deste estudo foi desenvolver um ensaio de reação em cadeia da polimerase (qPCR) associado ao corante monoazida de propídio (PMA) para avaliar a viabilidade celular de A. brasilense cepa FP2 em inoculantes e em raízes de milho. A. brasilense foi cultivado em meio de cultura específico submetido à tratamento térmico à 50ºC de zero a 240 min. Raízes de milho foram cultivadas in vitro e colhidas sete dias após a inoculação (DAI). A quantificação de A. brasilense foi realizada por qPCR, PMA-qPCR e contagem de colônias em placa. A qPCR foi realizada utilizando iniciadores específicos para a cepa AzoR2.1. As eficiências das curvas padrão variaram de 85% a 99%. Os limites de detecção (LOD) foram 102 cópias do genoma e 104 UFC / g de raiz fresca. Os resultados obtidos usando PMA-qPCR e contagem em placa após tratamento térmico foram semelhantes (de 107 a 102 e 107 a 100 UFC/mL) e a diminuição das UFC de A. brasilense foram observadas de acordo com o aumento do tempo de aquecimento. Enquanto isso, os resultados obtidos por qPCR permaneceram constantes (de 108 a 106 UFC/mL). Os resultados de enumeração obtidos para de raízes de milho por qPCR (~ 8 log UFC/g) foram maiores que os obtidos por PMA-qPCR (~ 5 ou 6 log UFC/g) e contagem em placa (~ 5 ou 6 log UFC/g) . Estes resultados mostraram que o ensaio PMA-qPCR foi eficiente na quantificação de células viáveis de inoculantes e quando comparado com métodos dependentes de cultura, a combinação de PMA-qPCR forneceu resultados confiáveis de maneira rápida e precisa.

Abstract : Azospirillum brasilense is a plant growth promoting bacteria (PGPB) being already used as inoculant in diverse crop plants. Since essential condition for effective phytoestimulation is PGPB capacity to survive in the rhizosphere, accurate analytical methods are required to identify and monitor viable cells in inoculant formulations or in planta. The aim of this study was to develop a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay associated to propidium monoazide dye (PMA) in order to evaluate the cells viability of A. brasilense strain FP2 in inoculant and in maize roots. A. brasilense was grown in specific culture medium and exposed to 50ºC heating treatment from zero up to 240 min. Maize roots were grown in vitro and harvested 7 days after inoculation (DAI). A. brasilense quantification was performed by qPCR, PMA-qPCR, and plate counting. qPCR was performed using AzoR2.1 strain-specific primers. Standard curves efficiency values ranged from 85% to 99%. The limits of detection (LOD) were 102 genome copies and 104 CFU/g of fresh root. Results of PMA-qPCR and plate counting after heat treatment were similar, decreasing of A. brasilense CFU was observed in accordance with the increase of the heating time, ranging from 107 to 102 and 107 to 100 UFC/mL, respectively. Meanwhile, qPCR results remained constant. A. brasilense enumeration obtained in maize roots by qPCR (~ 8 log CFU/g) where higher than enumeration by PMA-qPCR (~ 5 or 6 log CFU/g) and by plate counting (~ 5 or 6 log CFU/g). These results showed that the PMA-qPCR assay was efficient in quantifying inoculant viable cells and compared to culture-dependent methods, PMA-qPCR combination provides reliable results in a quickly and accurately way.