Vias de transdução envolvidas na reatividade vascular mediada por receptores a1-adrenérgicos na sepse: uma conversa entre o óxido nítrico e o cálcio?

Abstract

Uma vez que ligantes dos receptores a1-adrenérgicos (a1-ARs) se constituem como um pilar de primeira escolha no tratamento da hipotensão na sepse, buscamos com este trabalho, explorar o comportamento dos a1-ARs nessa condição. A hipótese que embasou a pesquisa é de que a estimulação de a1-ARs por diferentes ligantes pode resultar em uma modulação diferencial para mediadores intracelulares como o óxido nítrico (NO) e o cálcio (Ca2+), afetando a capacidade dos vasos em aumentar o tônus vascular. Utilizamos o modelo experimental de sepse induzida pela metodologia de ligadura e perfuração do ceco (CLP) em ratos, em dois tempos, pós CLP 6 h e 18 h. Avaliamos a responsividade da aorta frente aos agonistas fenilefrina (PE) e noradrenalina (NE), assim como a ativação direta da maquinaria contrátil pelo CaCl2. O receptor a1-AR quando ativado pela PE, resulta em uma hiporresponsividade mais acentuada do que quando ativado pela NE em 6 h após a CLP. A análise da densidade basal do receptor a1-AR através da técnica de marcação com o ligante fluorescente demonstra não haver reduções na densidade deste receptor na sepse. Além disso, a avaliação do efeito da sepse sobre a maquinaria contrátil em anéis de aorta, caracteriza que em 6 h após a CLP, a contração induzida por CaCl2 em líquido despolarizante sem Ca2+ não é reduzida. No entanto, estágios mais avançados da sepse apresentam perda do tônus contrátil ao CaCl2. A exploração das vias de transdução envolvidas denota que o inibidor não seletivo das sintases do óxido nítrico (L-NAME) é capaz de aumentar a responsividade vascular para a PE e NE em anéis de aorta provenientes do grupo controle. No entanto, não foi capaz de aumentar a responsividade vascular frente ao CaCl2. Ao contrário do esperado, em 6 h após a CLP, os inibidores seletivos das sintases de óxido nítrico induzida (iNOS), neuronal (nNOS) 1400W e S-metil-L-tiocitrulina, respectivamente, aumentaram as respostas para a PE, mas não para a NE nem para o CaCl2. A análise em um momento pós CLP mais tardio (18 h), demonstra que o bloqueio da eNOS, iNOS e nNOS é capaz de aumentar a responsividade vascular para todos os vasoconstritores avaliados. De maneira interessante, ao incubar a aorta de animais controle com o doador exógeno de NO, nitroprussiato de sódio (NPS) e construir CCRs (curvas de resposta dependentes da concentração) para a PE e NE, os resultados mostram diferenças em relação à sensibilidade ao NO de um vasoconstritor para o outro. Por outro lado, não encontramos diferenças entre os dois ligantes em relação à entrada de Ca2+ do meio extracelular. De outra forma, uma vez que a maquinaria contrátil já esteja ativada, o bloqueio da entrada de Ca2+ com a nicardipina é suficiente para provocar a perda do tônus vascular nas respostas induzidas por PE, tanto nas preparações controle, quanto sépticas, enquanto nas respostas geradas pela NE o mesmo não é observado. Por fim, verificamos particularidades importantes na sinalização mediada por PE e NE, no qual a NE é capaz de iniciar uma segunda onda de contração após atingir o platô, tanto em aorta de animais controle quanto sépticos. Dessa forma, concluímos que no início da sepse, a diferença de resposta vascular entre os dois ligantes do a1-AR está relacionada a uma modulação diferencial do NO, e que por outro lado, estágios mais tardios estão relacionados a um prejuízo da maquinaria contrátil, e independente do ligante utilizado, há perda do tônus, que é revertida por inibidores das NOS.

Abstract: Since a1-adrenergic receptor ligands (a1-ARs) constitute a pillar of first choice in the treatment of hypotension in sepsis, this study intends to explore the behavior of a1- ARs in this condition. The hypothesis that supported the research is that the stimulation of a1-ARs by different ligands can result in a differential modulation for intracellular mediators such as nitric oxide and calcium (Ca2+), affecting the capacity of vessels to increase vascular tone. We used the experimental model of sepsis induced by the cecal ligation and puncture (CLP) methodology in rats, in two stages, after CLP 6 h and 18 h. We evaluated the responsiveness of the aorta to phenylephrine (PE) and norepinephrine (NE) agonists, as well as the direct activation of the contractile machinery by CaCl2. The a1-AR receptor when activated by PE results in greater hyporesponsiveness than when activated by NE 6 h after CLP. The analysis of the basal density of the a1-AR receptor using the fluorescent ligand labeling technique demonstrates that there are no reductions in the density of this receptor in sepsis. Furthermore, the evaluation of the effect of sepsis on the contractile machinery in aortic rings characterizes that at 6 h after CLP, the contraction induced by CaCl2 in Ca2+ free depolarizing solution is not reduced. However, more advanced stages of sepsis show loss of contractile tone to CaCl2. The exploration of the involved transduction pathways shows that the non-selective inhibitor of nitric oxide synthases (L-NAME) is able to increase vascular responsiveness to PE and NE in aortic rings from the control group. However, it was not able to increase vascular responsiveness to CaCl2. Contrary to expectations, at 6 h after CLP, selective inhibitors of induced nitric oxide synthases (iNOS), neuronal (nNOS) 1400W and S-methyl-L-thiocitrulline, respectively, increase responses to PE, but not for NE or for CaCl2. Analysis at a later post-CLP time point (18 h) demonstrates that blocking eNOS, iNOS and nNOS can increase vascular responsiveness to all evaluated vasoconstrictors. Interestingly, by incubating the aorta of control animals with the exogenous NO donor, sodium nitroprusside (NPS) and constructing CCRs (concentration response curves) for PE and NE, the results show differences in relation to sensitivity to NO from one vasoconstrictor to another. On the other hand, we found no differences between the two ligands regarding the entry of Ca2+ from the extracellular medium. Otherwise, once the contractile machinery is already activated, blocking the entry of Ca2+ with nicardipine is sufficient to cause loss of vascular tone in PE-induced responses, both in control and septic preparations, while in generated responses by NE, the same is not observed. Finally, we verified important particularities in the signaling mediated by PE and NE, in which NE is able to initiate a second wave of contraction after reaching the plateau, both in the aorta of control and septic animals. Thus, we conclude that at the early sepsis, the difference in vascular response between the two a1-AR ligands is related to a differential modulation of NO. However, late stages are related to an impairment of the contractile machinery, and regardless of the ligand used, there is loss of tone, which is reversed by NOS inhibitors.