Pneumosepse induzida por Klebsiella pneumoniae em camundongos: caracterização comportamental e perfil neuroinflamatório

Abstract

O aumento da sobrevida de pacientes críticos, devido aos avanços tecnológicos, tem resultado em uma população crescente de sobreviventes a síndromes agudas e complexas, como a sepse. Nesta esfera, consequências neuropsiquiátricas têm aumentado nesses indivíduos, como declínio cognitivo, transtorno-depressivo maior e ansiedade. Não obstante, o papel causal de disfunções neurológicas - sejam elas de curto ou longo prazo - relacionadas à sepse ainda permanecem pouco explorados, bem como seus mecanismos fisiopatológicos. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar as repercussões sistêmicas, os parâmetros comportamentais e neuroinflamatórios em camundongos com pneumosepse induzida por instilação intratraqueal de Klebsiella pneumoniae. Foram utilizados camundongos Swiss, machos, os quais foram separados aleatoriamente nos seguintes grupos: pneumosepse (animais submetidos à instilação intratraqueal de 0,05 mL de uma solução com Klebsiella pneumoniae ? 5,9x109 UFC/animal e controle (animais submetidos à instilação intratraqueal de 0,05 mL de solução tampão - PBS). A fim de ratificar o modelo de pneumosepse, foram avaliados alguns de seus marcadores de lesões sistêmicas características, como níveis de ureia e creatinina, perfil hematológico, presença de unidades formadoras de colônia (UFC) no sangue e no encéfalo e permeabilidade vascular tecidual (Azul de Evans). Em uma segunda etapa experimental, os camundongos foram avaliados quanto aos parâmetros comportamentais nos períodos de 24h, 7, 14 e 30 dias após a pneumosepse. Para tanto, foram realizados teste de campo aberto (TCA), teste do labirinto em cruz elevada (LCE) a fim de avaliar o comportamento tipo ansioso e teste de suspensão pela cauda (TSC) e teste de borrifagem de sacarose (TBS), a fim de avaliar o comportamento tipo-depressivo. O teste de reconhecimento de objetos (RO) foi utilizado a fim de avaliar a memória. O perfil inflamatório, que incluiu a avaliação da atividade da mieloperoxidade (MPO) e a quantificação dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), interleucina 1 beta (IL-1ß) e interleucina-6 (IL-6), nos pulmões, hipocampo e córtex pré-frontal foi mensurado 24 horas, 7, 14 e 30 dias após a indução da pneumosepse. Adicionalmente, foi realizada a avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) por meio de Azul de Evans e da ativação microglial, através de imunohistoquímica. Desta forma, este modelo de pneumosepse, resultou em lesão distal ao órgão alvo, com aumento dos níveis de creatinina e ureia nos grupos com pneumosepse, aumento da permeabilidade vascular tecidual em órgãos como pulmão, fígado, intestino e coração. Assim como, alteração da integridade da barreira hematoencefálica em 24 após a lesão, evidenciada por meio de extravasamento de Azul de Evans e disseminação bacteriana no sangue e no encéfalo dos animais nos períodos de 24, 48 e 72 horas. Além disso, ocorreu um aumento significativo dos níveis de MPO no pulmão (até 7 dias) e córtex pré-frontal (24h) com aumento de citocinas pró-inflamatórias no pulmão, hipocampo e no córtex pré-frontal. Paralelamente foi demonstrado a ativação de micróglia no hipocampo, com aumento da porcentagem da área positiva para IBA1. Foi observado comportamento tipo-depressivo e tipo-ansioso nos animais em todos os períodos avaliados que se correlacionaram com os níveis de citocinas no hipocampo (TNF-a, IL-1ß, IL-6), além de alterações na memória de curto prazo nos períodos de 14 e 30 dias após a pneumosepse. Portanto, este estudo demonstrou, pela primeira vez, que a pneumosepse induzida por Klebsiella pneumoniae promoveu resposta neuroinflamatória e comportamentos tipo-depressivo e ansioso; bem como alterações de memória à curto prazo, sugerindo um efeito significativo da inflamação pulmonar e sistêmica no SNC.

Abstract: Technological advances increased survival of critically ill patients with acute and complex syndromes, such as sepsis, increasing neuropsychiatric consequences (e.g., cognitive decline, major depressive disorder, and anxiety). Nevertheless, the causal role of neurological disorders - whether short-term or long-term ? and pathophysiological mechanisms related to sepsis remains poorly explored. Thus, this study aimed to characterize systemic repercussions, behavioral and neuroinflammatory parameters in mice with pneumosepsis induced by intratracheal instillation of Klebsiella pneumoniae. Male Swiss mice were randomly divided into the following groups: pneumosepsis (animals submitted to intratracheal instillation of 0.05 mL of Klebsiella pneumoniae ? 5.9x109 CFU/animal) and controls (animals submitted to intratracheal instillation of 0.05 mL of phosphate buffered solution). We also evaluated some markers of systemic lesion (e.g., urea and creatinine levels, hematological profile, presence of colony-forming units [CFU] in blood and brain and tissue vascular permeability ? Evans Blue) to confirm the pneumosepsis model. In a second experimental, behavioral parameters were evaluated 24h, 7, 14, and 30 days after pneumosepsis. Open field test and elevated plus-maze test assessed anxiety-like behavior, whereas tail suspension test and sucrose splash test assessed depressive-like behavior. Object recognition test was used to assess memory. Inflammatory profile, including myeloperoxidation (MPO) activity, tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interleukin-1 beta (IL-1ß), and interleukin-6 (IL-6) levels in lungs, hippocampus, and prefrontal cortex, was measured 24 hours, 7, 14, and 30 days after pneumosepsis. The blood-brain barrier (BBB) permeability was performed using Evans Blue. Microglial activation was also assessed using immunohistochemistry. This pneumosepsis model resulted in injury distal to the target organ, increased levels of creatinine and urea in mice with pneumosepsis, increased vascular permeability in lungs, liver, intestine, and heart, altered BBB integrity 24 hours after injury (evans blue extravasation), and bacterial dissemination in the blood and brain of animals after 24, 48, and 72 hours. Furthermore, MPO levels increased significantly in the lung (up to 7 days) and prefrontal cortex (24 h), while proinflammatory cytokines elevated in lungs, hippocampus, and prefrontal cortex. Parallel to this, microglial activation was demonstrated in hippocampus, with increased percentage of positive area for IBA1. Depressive-like and anxious-like behaviors were observed in all periods assessed, which correlated with cytokine levels in hippocampus (TNF-a, IL-1ß, and IL-6), in addition, changes in short-term memory were observed at 14 and 30 days. Therefore, this study demonstrated, for the first time that pneumosepsis induced by Klebsiella pneumoniae promoted neuroinflammatory response and depressive-like and anxious behaviors, as well s short-term memory alterations, suggesting a significant of pulmonary and systemic inflammation in the CNS.