Evolução de Zika virus durante o tratamento com ivermectina

Abstract

O Zika virus (ZIKV) é um vírus de RNA, membro da família Flaviviridae e gênero Flavivirus, transmitido por mosquitos do gênero Aedes sp. As recentes epidemias causadas pelo ZIKV geraram sérios problemas de saúde pública por todo o mundo por causar complicações neurológicas graves em adultos e crianças. Atualmente não existem vacinas preventivas ou fármacos anti-ZIKV licenciados. Como a busca por drogas antivirais é alta, redirecionar medicamentos previamente aprovados é um caminho mais rápido. Um exemplo disso é a ivermectina (IVM), que está em estudo clínico com humanos para tratar infecções causadas por DENV e se mostra promissora também para tratar infecções com ZIKV. Entretanto os vírus de RNA podem apresentar resistência as drogas antivirais por apresentarem uma ampla variabilidade genética (quasispécies), devido à alta taxa de mutação intrínseca associada à polimerase (RdRp) viral. Diante disso, o presente trabalho objetivou induzir o ZIKV (cepa BR15261) a adquirir resistência a IVM. Para tal propomos um protocolo de evolução viral em células A549 e C6/36 que simule pressões de seleção suficientes para prever mutações no genoma do vírus, que possam levar a falha do tratamento a longo prazo. Para realização deste protocolo as células A549 foram tratadas com 10 µM de IVM e seu respectivo veículo por 4h seguidas da infecção com MOI 0,3 de ZIKV. Já as passagens em C6/36 foram realizadas por 84 horas na ausência da droga. Os resultados demonstraram que essa concentração da droga não apresentou efeitos citotóxicos consideráveis e diminuiu o título viral de ZIKV frente ao pré-tratamento das células. Também foram observadas modificações fenotípicas do vírus a partir das passagens três (p3), como alteração no tamanho da placa de lise e queda no título viral. Os resultados aqui apresentados sugerem que o fitness viral possa ter sofrido alterações já nas primeiras passagens e que na p5b tenha ocorrido a perda das quasispécies com maior fitness da população. Por consequência, os títulos decrescentes observados até a p7a seriam em função da adaptação das quasispécies de menor fitness. No entanto ainda não é possível afirmar que os vírus tenham adquirido resistência à IVM. Por isso é necessário que mais passagens sejam realizadas, bem como o sequenciamento genômico para análise da evolução das quasispécies na população. Todavia o protocolo de passagens virais aqui padronizado e demais dados do uso da IVM em nosso sistema será útil para a realização de novos ensaios que visem explorar o uso da IVM como tratamento para ZIKV e/ou outros Flavivirus.

Abstract: Zika virus (ZIKV) is an RNA virus, member of the Flaviviridae family and Flavivirus genus, transmitted by Aedes sp. The recent epidemics caused by ZIKV have caused severe neurological complications in adults and children creating public health concerns around the world. Currently, there is no licensed vaccine to prevent or drugs available to treat ZIKV infections. As the search for antiviral drugs is urgent, the repurpose of approved drugs is a quicker route to provide an option of treatment. One example is ivermectin (IVM), an antiparasitic drug currently on a clinical study to treat DENV infections and with promising results pointing its use also for ZIKV infections. However, RNA viruses can be resistant to antiviral drugs because their wide genetic variability (quasispecies) caused by the high rate of intrinsic mutation associated to the viral polymerase (RdRp). Therefore, this study aimed to induce ZIKV (strain BR15261) to acquire resistance to IVM. To this end, we proposed a protocol for viral evolution by alternating passages in A549 and C6/36 cells. This protocol simulates selection pressures to predict mutations in the virus genome that could lead to failure in the longterm usage of this drug. In the protocol, A549 cells were treated with 10 µM of IVM or vehicle for 4 hours followed by infection with ZIKV at MOI 0.3. Passages on C6/36 cells, on the other hand, were performed for 84h in the absence of the drug. The results have shown limited cytotoxicity of IVM in cells and confirmed its viral activity against ZIKV. Changes in the virus phenotype, such as a decrease of plaque size and viral titers were also observed from the third passage (p3). These results suggest that viral fitness may have undergone changes and from p5b the loss of quasispecies with greater fitness within the population has occurred. By consequence, the adaptation of lesser fitness quasispecies would explain the decreasing titers observed up to p7a. However, up to this point, it is not yet possible to say that viruses have acquired resistance to IVM. To do so it is necessary to perform more passages, as well as genomic sequencing to analyze the evolution of quasispecies within the population. Nonetheless, the viral passages protocol here developed and described as well as all data on the use of IVM in our system will be useful to carry out new tests aiming to further explore the use of IVM as a treatment for ZIKV and/or other Flaviviruses.