Caracterização molecular de enterobactérias multirresistentes

Abstract

A resistência antimicrobiana tornou-se um problema de saúde pública mundial. Plasmídeos são os principais vetores para a disseminação de determinantes de resistência, possuem capacidade de replicação em diferentes hospedeiros, são capazes de incorporar em seu genoma diversos determinantes de resistência interessantes para a sobrevivência do seu hospedeiro e possuem grande capacidade de recombinação genética. Com base nessa problemática, este estudo teve como principal objetivo a caracterização molecular de plasmídeos de enterobactérias multirresistentes isoladas em um hospital universitário. Foram selecionados 140 isolados de Enterobacterales, sendo 33 E. coli, 58 K. pneumoniae, 34 E. cloacae e 15 outras espécies. A identificação e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi feita pela metodologia semi-automatizada Vitek 2. Doze genes ß-lactamases foram pesquisados por qPCR e a identificação dos grupos de incompatibilidade dos plasmídeos foi feita por PBRT. A determinação da similaridade genética foi feita por PFGE. Após essa triagem, foram selecionados 12 isolados para sequenciamento do genoma completo pela metodologia de shotgun pela plataforma Illumina, dois isolados de E. coli carreando o gene mcr-1, um isolado de E. coli e um de K. pneumoniae carreando o gene blaNDM-1, dois isolados de K. pneumoniae carreando o gene blaVIM-1 e sete isolados carreando o gene blaKPC-2, dentre eles um E. coli, um E. cloacae e cinco K. pneumoniae. Os plasmídeos que carreavam mcr-1 eram provenientes de isolados comunitários e pertenciam ao grupo IncX4, muito similar aos plasmídeos carreadores de mcr-1 descritos no Brasil. Os isolados que continham o gene blaNDM-1 eram de espécies diferentes, porém foram recuperados em coletas distintas, do mesmo paciente. Não foi possível determinar em qual plasmídeo o gene blaNDM-1 estava localizado, no entanto o mesmo se encontrava flanqueado pela sequência de inserção ISAba125 e pelo gene bleMBL. Os isolados que carreavam o gene blaKPC-2 eram de diferentes espécies e recuperados de diferentes sítios, e apesar de não ter ocorrido a montagem completa do plasmídeo pesquisado em todos os isolados, todos os plasmídeos pertenciam ao mesmo grupo IncN, onde o gene blaKPC-2 estava localizado dentro do transposon Tn4401, o qual continha duas sequências de inserção ISKpn6 e ISKpn7, três transposases tnpA-1, tnpA-2, istA e uma resolvase tnpR. O plasmídeo IncN contendo blaKPC-2, assim como todo o contexto genético em que o gene de resistência estava inserido apresentou alta identidade com outros plasmídeos descritos no país. Com esse estudo pode-se observar uma possível transferência plasmidial in vivo ocorrida com o gene blaNDM-1. Ainda, parece haver no Brasil dois plasmídeos endêmicos responsáveis pela disseminação de determinantes de resistência, um IncN responsável pela disseminação de blaKPC-2 e um IncX4 responsável pela disseminação de mcr-1.<br>

Abstract: Antimicrobial resistance has become a global public health problem. Plasmids are the main vectors for the resistance determinants dissemination, since they have replication capacity in a wide variety of hosts, they are able to incorporate several resistance genes in their genomes that are interesting for bacteria survival and have great capacity of genetic recombination. Therefore, this study had as main purpose characterize molecularly multiresistant Enterobacteriaceae plasmids isolated in an Universitary Hospital. Fourteen hundred Enterobacterales isolates were selected, being 33 E. coli, 58 K. pneumoniae, 34 E. cloacae and 15 from other species. The identification and antimicrobial susceptibility test were performed using semi-automated methodology Vitek 2. Twelve ß-lactamases genes were investigated by qPCR and incompatibility groups of the plasmids identification was performed by PBRT. The genetic similarity determination was performed by PFGE. After this screening, twelve isolates were selected to be submitted to complete genome sequencing by the Illumina shotgun methodology, two E. coli isolates carrying mcr-1 gene, one E. coli and one K. pneumoniae carrying blaNDM-1, two K. pneumoniae isolates carrying blaVIM-1 gene and seven isolates carrying blaKPC-2, among them one E. coli, one E. cloacae and five K. pneumoniae. Plasmids bearing mcr-1 were recouvered from community isolates and belonged to IncX4 group, and they were very similar to IncX4 plasmids carrying mcr-1 described in other states in Brazil. The isolates carrying blaNDM-1 were from different species, recovered from different samples from the same patient. It was not possible to determine in which plasmid blaNDM-1 was localized, however blaNDM-1 gene was flanked by ISAba125 insert sequence and bleMBL resistance gene. Isolates bearing blaKPC-2 were from different species and retrieved from different sites, but although complete plasmid assembly for in all isolates did not occur, all plasmids belonged to the same IncN group, in which blaKPC-2 was located within transposon Tn4401b, which contained two insertion sequences ISKpn6 and ISKpn7, three transposases tnpA-1, tnpA-2, istA and a resolvase tnpR. The IncN carrying blaKPC-2 plasmid and the entire genetic environment in which the resistance gene was inserted showed high identity with other plasmids described in the country. With this study we can observe a possible in vivo plasmid transfer occurring with isolates carried blaNDM-1. It is possible there are two endemic plasmids in Brazil responsible for resistance determinants dissemination, an IncN responsible for blaKPC-2 dissemination and an IncX4 responsible for the adquired resistance polymyxin gene dissemination, mcr-1.