Avaliação pré-clínica do efeito anti-inflamatório de imidazóis inéditos

Abstract

A inflamação continua sendo hoje um dos principais fatores agravantes de diferentes doenças e, como tal, é uma das grandes responsáveis pelo congestionamento de clínicas médicas e atendimento em saúde de forma geral. Os imidazóis, tanto naturais como sintéticos, são moléculas conhecidas pelo seu amplo espectro de efeitos biológicos, incluindo nestes a atividade anti-inflamatória. Nesta tese, o foco inicial foi triar dentre oito moléculas inéditas de imidazóis tetra substituídos sintetizadas na Universidade Federal de Santa Catarina, quais apresentariam efeito anti-inflamatório in vitro. Para tal, as oito moléculas foram testadas in vitro em cultura de macrófagos J774 estimulados com LPS, em concentrações não citotóxicas, frente a sua capacidade de inibir a secreção de metabólitos do óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias. Na sequência, as moléculas com efeito significativo foram testadas in vivo em modelo de pleurisia induzida pela carragenina. Dos sete imidazóis analisados nesta fase, um Fluorofenil-imidazol (8) se destacou, apresentando resultados promissores in vitro, inibindo a secreção de metabólitos do óxido nítrico e das citocinas (TNF-a, IL-6 e IL-1ß), além de manter este padrão de efeito também in vivo, atenuando a migração de leucócitos e exsudação na cavidade pleural de camundongos que sofreram a pleurisia induzida pela carragenina. Somado a estes resultados, este Fluorofenil-imidazol reverteu o padrão de estresse oxidativo desencadeado pela carragenina na cavidade pleural, diminuindo de forma significativa a atividade da mieloperoxidase, superóxido dismutase, catalase e glutationa-S-transferase, além de reduzir a produção de metabólitos do óxido nítrico e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Na sequência, o Fluorofenil-imidazol também foi analisado novamente in vitro frente a sua capacidade de inibir a translocação da subunidade p65 do NF-?B para o núcleo, também em macrófagos J774 estimulados por LPS e, nestes experimentos, esta molécula demonstrou efeitos inibitórios sobre este fator de transcrição. Partindo destes resultados de triagem, a segunda parte desta tese foi direcionada para análise da atividade do Fluorofenil-imidazol em modelo específico de lesão aguda pulmonar induzida por LPS in vivo, mimetizando as condições encontradas em pacientes com Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo, além de avaliar a toxicidade oral aguda deste composto em modelo in vivo sugerido pela OECD nº 423. Os resultados destas analises demonstram que o Fluorofenil-imidazol tem a capacidade de inibir a migração leucocitária e exsudação nos pulmões de camundongos instilados instranasalmente com LPS, além de manter a arquitetura pulmonar destes animais preservada. Somado a isto, o composto em questão diminui de forma significativa a atividade da enzima mieloperoxidase, assim como as concentrações de metabólitos de óxido nítrico e das citocinas TNF-a, IL-6, IL-17, IFN? e IL-10. Estes efeitos inibitórios se deram, ao menos em parte, a capacidade do Fluorofenil-imidazol de inibir a fosforilação da subunidade p65 do NF-?B e da MAPK p38 no tecido pulmonar dos camundongos. Finalmente, os resultados relacionados a toxicidade oral aguda indicaram que esta molécula não exibe perfil tóxico em modelo de tratamento agudo, sendo sua LD50 estimada pelo algoritmo da OECD nº 423 maior que 5000 mg/kg. Conclui-se desta forma que o Fluorofenil-imidazol é uma molécula com importante efeito anti-inflamatório, e testes específicos relacionados ao seu exato mecanismo de ação e toxicidade de doses repetidas possibilitariam avançar na pesquisa para desenvolvimento de um protótipo anti-inflamatório baseado em sua estrutura molecular.

Abstract: Inflammation continues to be one of the main aggravating factors of different diseases and, as such, is one of the main responsible for the congestion of medical clinics and health care in general. Imidazoles, both natural and synthetic, are molecules known for their broad spectrum of biological effects, including anti-inflammatory activity. In this thesis, the initial focus was to screen eight molecules of tetra substituted imidazoles synthesized at the Federal University of Santa Catarina, and analyze if any of it presented anti-inflammatory effect in vitro. To that end, the eight molecules were tested in vitro in culture of LPS-stimulated J774 macrophages at non-cytotoxic concentrations, against their ability to inhibit the secretion of nitric oxide metabolites and pro-inflammatory cytokines. Subsequently, molecules with significant effect were tested in vivo in a carrageenan-induced pleurisy model. Of the seven imidazoles analyzed at this stage, a Fluorophenyl imidazole (8) was highlighted, showing promising results in vitro, inhibiting the secretion of nitric oxide metabolites and cytokines (TNF-a, IL-6 and IL-1ß). This inhibitory pattern was maintained in vivo, attenuating leukocyte migration and exudation in the pleural cavity of mice that suffered carrageenan-induced pleurisy. In addition to these results, this Fluorophenyl imidazole reversed the oxidative stress pattern triggered by carrageenan in the pleural cavity, significantly reducing the activity of myeloperoxidase, superoxide dismutase, catalase and glutathione-S-transferase, along with the reduction on the production of oxide metabolites nitric and thiobarbituric acid reactive substances. Fluorophenyl imidazole was also analyzed again in vitro against its ability to inhibit the translocation of the p65 subunit of NF-?B to the nucleus, also in LPS-stimulated J774 macrophages, and in these experiments this molecule demonstrated inhibitory effects on this transcription factor. Based on these screening results, the second part of this thesis was directed to the analysis of the activity of Fluorophenyl imidazole in a specific model of acute lung injury induced by LPS in vivo, mimicking the conditions found in patients with acute respiratory distress syndrome, and the acute oral toxicity of this compound in a in vivo model suggested by OECD No. 423. The results of these analyzes demonstrate that Fluorophenyl imidazole has the ability to inhibit leukocyte migration and exudation in the lungs of mice instilled with LPS intranasal, in addition to maintaining the pulmonary architecture of these animals preserved. In addition, the compound in question significantly decreases the activity of the myeloperoxidase enzyme, as well as the concentrations of nitric oxide metabolites and cytokines TNF-a, IL-6, IL-17, IFN? and IL-10. These inhibitory effects were at least in part due to the ability of Fluorophenyl imidazole to inhibit the phosphorylation of the p65 subunit of NF-?B and p38 MAPK in the lung tissue of mice. Finally, results related to acute oral toxicity indicated that this molecule does not exhibit a toxic profile in an acute treatment model, its LD50 being estimated by the OECD algorithm no. 423 higher than 5000 mg/kg. It is concluded that Fluorophenyl imidazole is a molecule with an important anti-inflammatory effect, and specific tests related to its exact mechanism of action and toxicity of repeated doses would allow to advance the research for the development of an anti-inflammatory prototype based on its structure molecular.