Microbiota associada a bambu e procedimentos de desinfecção como subsídios ao estabelecimento de culturas viáveis de células, tecidos e órgãos

Abstract

Este trabalho buscou estudar a fase de estabelecimento in vitro do bambu sob duas abordagens: um experimento tradicional, o qual avaliou a presença de biocida e antibiótico no meio de cultura, bem como sua estrutura física e; um levantamento da microbiota associada aos segmentos nodais (fonte de explante para o estabelecimento in vitro) por meio de ferramentas de metagenômica metabarcoding. O experimento de estabelecimento in vitro avaliou a presença de casugamicina, PPM-Plant Preservative Mixture® e ágar no meio de cultura em três espécies de bambu: Bambusa vulgaris, Phyllostachys bambusoides e Dendrocalamus asper. Os resultados mostraram um efeito significativo na interação dos fatores, onde as concentrações 2 e 4 ml/L de PPM e o meio de cultura líquido foram mais eficientes na diminuição de contaminação e oxidação dos explantes e, no estabelecimento efetivo dos explantes. O inventário da microbiota associada a Dendrocalamus asper foi realizada por meio do sequenciamento de amplicons metabarcoding de Archaea, Baceria e Fungi. Os resultados revelaram, pela primeira vez, a diversidade e estrutura das comunidades em segmentos nodais e meio de cultura na fase de estabelecimento de uma espécie de bambu. Foram revelados 1.070 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs), sendo 12 de Archaea, 391 de Bacteria, e 667 de Fungi. Em Archaea foi identificado o filo Thaumarchaeota, e os gêneros Candidatus Nitrosopumilus e Candidatus Nitrososphaera. Em Bacteria, os filos mais abundantes foram Proteobacteria, Firmicutis, Bacteroidetes, Actinobacteria, Acidobacteria, sendo o gênero Pantoea responsável pela maior abundância de sequências no meio de cultura, indicando um possível contaminante. Em Fungos, foram identificados os filos Ascomycota e Basidiomycota, onde as classes Sordariomycetes e Dothideomycetes foram responsáveis pela maior abundância de sequencias, notadamente a ordem Pleosporales. O sequenciamento de amplicons se mostrou uma ferramenta eficaz na determinação de micro-organismos potencialmente contaminantes do estabelecimento in vitro revelando a presença e abundância de grande número de táxons no meio de cultura, podendo também revelar micro-organismos benéficos ao desenvolvimento das culturas in vitro.

Abstract : This work aimed at to study the in vitro establishment phase of bamboo under two approaches: a traditional experiment, which evaluated the presence of biocide and antibiotic in the culture medium, as well as its physical structure and; a survey of the microbiota associated with nodal segments (source of explant for in vitro establishment) by metagenomic tools - metabarcoding. The in vitro establishment approach evaluated the presence of casugamycin, PPM (Plant Preservative Mixture®) and agar in the culture medium in three bamboo species: Bambusa vulgaris, Phyllostachys bambusoides and Dendrocalamus asper. The results showed a significant effect on the interaction of the factors and the concentrations of 2 and 4 ml/L of PPM and the liquid culture medium were more efficient in reducing contamination and oxidation of the explants, as well as in the effective establishment of viable cultures. The inventory of the microbiota associated with Dendrocalamus asper was performed through the amplicon sequencing - metabarcoding - of Archaea, Baceria and Fungi. The results revealed for the first time the diversity and structure of the communities in nodal segments and culture medium in the establishment phase of a bamboo species. A total of 1,070 Operational Taxonomic Units (OTUs) were revealed, 12 of Archaea, 391 of Bacteria, and 667 of Fungi. In Archaea was identified the phylum Thaumarchaeota, and the genera Candidatus Nitrosopumilus and Candidatus Nitrososphaera. In Bacteria, the most abundant phyla were Proteobacteria, Firmicutis, Bacteroidetes, Actinobacteria, Acidobacteria, being the genus Pantoea responsible for the greater abundance of sequences in the culture medium, indicating a possible contaminant. In Fungi, the Ascomycota and Basidiomycota phyla were identified, where the classes Sordariomycetes and Dothideomycetes were responsible for the greater abundance of sequences, especially the order Pleosporales. Amplicon sequencing proved to be an effective tool in the determination of potentially contaminating microorganisms in vitro, revealing the presence and abundance of large numbers of taxa in the culture medium, and could also reveal microorganisms beneficial to the development of in vitro cultures.