Modelo de melanoesfera para pesquisa de novos agentes antitumorais

Abstract

O melanoma é um tipo de câncer altamente agressivo, com altas taxas de metástases e, em estágios avançados, é resistente aos tratamentos convencionais. A resistência ao tratamento e a recorrência da doença tem sido relacionadas à sobrevivência de um subconjunto de células denominadas células tronco tumorais (CTT). Esta população de células tem capacidade de auto-renovação e podem gerar descendentes heterogêneos mantendo algumas semelhanças com as células tumorais iniciais. Neste sentido, neste estudo desenvolveu-se um modelo de melanoesfera capaz de aumentar a expressão de marcadores associados às CTT, sem a utilização de meios de diferenciação a fim de avaliar a potencial atividade do sal de isotiourônio MF08 (SI-MF08) - composto já estudado pelo nosso grupo de pesquisa - frente a esta população de células. As melanoesferas foram obtidas a partir de baixa densidade celular (< 1célula/µL) em condições não aderentes, através do uso de gel de agarose 2 % em diferentes volumes (30, 40 e 50 µl/poço) para estabelecer a melhor condição de formação. O volume de 30 µL de agarose 2% parece ser a condição ideal para o modelo esferoide, uma vez que as melanoesferas formadas apresentaram um numero significativamente maior de células viáveis (6800 ± 1000 células/esferoide) quando comparadas aos demais volumes (2890 ± 730, 2047 ± 680 para 40 e 50 µL de agarose 2 %, respectivamente). A presença dos marcadores de superfície CD133 e CD44 foi escolhida para investigar se a formação de melanoesferas foi capaz de enriquecer a população de células com características associadas a CTT. Análises por microscopia confocal e citometria de fluxo foram então realizadas para identificar células CD133 e CD44 positivas em cultura monocamada (2D) de B16F10, bem como em melanoesferas. A percentagem de células CD133 positivas em cultura 2D foi de 20 % e aumentou para 76% nas melanoesferas. Para CD44, o aumento foi ainda maior, com uma porcentagem de células positivas em cultura 2D de 7 % e 83 % em melonoesferas. Além disso, as melanoesferas foram expostas a três concentrações diferentes de SI-MF08 (9, 17,5 e 35 µM) e no final do 7º dia de cultura, a exposição ao composto foi capaz de inibir significativamente o crescimento da melanoesferas em 15, 59 e 70 %, respectivamente. Diante dos resultados, foi demonstrado que é possível a formação de melanoesferas com alta porcentagem de células CD133 e CD44 positivas sem o uso de meio de diferenciação. Além disso, o modelo proposto torna-se uma ferramenta importante no estudo in vitro do potencial citotóxico de novos agentes antitumorais.

Abstract : Melanoma is a highly aggressive type of cancer due to the possibility of generating metastases and, in advanced stages it is resistant to conventional treatments. Resistance to treatment and disease recurrence has been linked to the survival of a subset of cells called cancer stem cells (CSC). This cell population has self-renewal capacity and can generate heterogeneous offspring that retain some similarities with the initial tumor. Thus, in this study, a melanosphere model was developed to increase the expression of markers associated with CSC, without the use of differentiation medium, in order to evaluate the potential activity of the isothiouronium salt MF08 (IS-MF08) a compound already studied by our research group - against this cell subset. The melanospheres were obtained through low cell density (<1cell / µl) under nonadherent conditions, using different volumes of agarose gel 2% (30, 40 and 50 µl / well) to establish the best formation condition. The volume of 30 µL of agarose appeared to be the ideal condition for the spheroid model since the melanospheres formed presented a significantly higher number of viable cells (6800 ± 1000) when compared to the other volumes ((2890 ± 730, 2047 ± 680 for 40 and 50 µL of agarose 2%, respectively). Confocal analyzes and flow cytometry were performed to identify positive ?CD133 and CD44 cells in monolayer culture (2D) of B16F10 as well as in melanospheres. ?The percentage of positive CD133 cells in a 2D culture was 20% and increased up ?to 76% in melanospheres. For CD44 the increase was even higher with a percentage of ?positive cells consisting in 7% going up to 83% in melanospheres. ?After confirmation that melanospheres hold a high percentage of both, CD133 and ?CD44 they were exposed to three different concentrations of IS-MF08 (9 µM, 17.5 µM and ?35 µM). At the end of the 7thday of culture, the exposure to the compound was able to significantly prevent melanosphere growth in 15%, 59% and 70%, ?respectively. Considering the results, it is possible the formation of melanospheres with high percentage of CD133 and CD44 positive cells without the presence of specific medium. In addition, the melanosphere model is an important tool in the in vitro study of the cytotoxic potential of new anticancer agents.