Clonagem e expressão das enzimas heterólogas xilose redutase e xilitol desidrogenase em Saccharomyces cerevisiae e análise do consumo de xilose por linhagens recombinantes

Abstract

O biocombustível tornou-se uma alternativa ao uso do petróleo. Nesse cenário o Brasil apostou no etanol. Industrialmente, sua produção acontece através do processo de fermentação alcóolica pela levedura Saccharomyces cerevisiae em matéria vegetal, como a cana-de-açucar (Saccharum spp.). Porém, a levedura não apresenta o metabolismo necessário para fermentar pentoses, como a xilose, um dos carboidratos mais abundantes em matéria lignocelulósica. Investigando leveduras que fermentam xilose, encontramos um processo de redução e oxidação mediado pelas enzimas Xilose Redutase (XR) e Xilitol Desidrogenase (XDH). Portanto, uma maneira de aumentar a produção de etanol no país, sem aumentar a área plantada de cana-de-açucar, é a criação de linhagens de S. cerevisiea transformantes com as enzimas supracitadas. Para isso, buscamos as enzimas com maior atividade entre as espécides fermentadoras de xilose, chegando as seguintes duas espécies: Spathaspora arborarie e Spathaspora passalidarum. Sendo que a enzima XR de S. arborarie, além de apresentar alta atividade, apresenta atividade com dois cosubstratos, NADPH e NADH. Já a enzima XDH de S. passalidarum apresentou a maior atividade entre as enzimas XDH já descritas, e uma dependência do cosubstrato NAD+. O uso conjunto das enzimas é interessante pela reciclagem dos cosubstratos. Portanto, nesse trabalho, buscamos criar um plasmídeo com um forte promotor constitutivo PGK para XR e TEF para XDH com a intenção de transformar o organismo S. cerevisiae para futura produção de etanol a partir de xilose. Além disso, estudos de engenharia genética demonstraram um efeito positivo da deleção do gene PHO13 de S. cerevisiae, já que essa mudança parece aumentar a expressão de enzimas da Via Glicolítica e da Via das Pentoses Fosfato. Por isso, utilizamos linhagens recombinantes pho13∆ com expressão das enzimas heterólogas supracitadas e comparamos seu perfil fermentativo com linhagens com a mesma expressão de enzimas, porém não pho13∆. Como resultado, percebemos que a expressão das enzimas permite o consumo de xilose, porém percebemos pouca produção de etanol. A linhagem pho13∆ se torna vantajosa em fermentação com alta densidade de xilose, 10%, produzindo o dobro de etanol da linhagem não pho13∆.