Identificação de transcritos em embriões de Macrobrachium olfersii: ênfase nos genes Hox e de segmentação e sua expressão durante o desenvolvimento embrionário

Abstract

Os estudos dos mecanismos moleculares do desenvolvimento em crustáceos são importantes para entender a diversidade morfológica deste grupo. No entanto, poucos estudos foram realizados, se consideramos a diversidade deste grupo. Dentre os camarões de água doce, Macrobrachium olfersii surge como um modelo potencial para estudos de desenvolvimento e de toxicidade. Porém, os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento ainda não foram descritos, pois poucas sequências são conhecidas nesta espécie. Neste contexto, o presente estudo teve os seguintes objetivos: 1) identificar transcritos com a finalidade de gerar um banco de sequências e contribuir no entendimento dos mecanismos moleculares nesta espécie; 2) identificar transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, em especial os genes Hox e genes de segmentação; 3) e analisar os níveis de seus transcritos durante o desenvolvimento embrionário de M. olfersii. Uma montagem de novo a partir de 25,6 milhões de reads e análise transcriptômica de pool de embriões (E4-E8) proporcionou 99.751 unigenes. Do total, 20,95% foram similares às sequências do banco de dados GenBank. Uma diversidade de transcritos foi classificada por ontologia gênica (21.845 unigenes) e em 129 vias (6.866 unigenes) do KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Os transcritos de genes codificados pelo DNA mitocondrial (22 tRNA, 2 rRNA e 13 genes codificantes de proteínas) também foram identificados. Na análise do transcriptôma utilizando ontologia gênica, 2.142 unigenes foram classificadas na categoria de processos do desenvolvimento e 553 unigenes na subcategoria do desenvolvimento embrionário, cujas sequências foram mais similares aos artrópodes Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus. Além disso, os transcritos de genes do padrão ântero-posterior, do padrão dorso-ventral, de vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, Hedgehog, Jak-STAT, VEGF) e dos receptores nucleares induzíveis por ecdiesteróides foram identificados. Através da PCR com iniciadores degenerados foram identificados transcritos dos genes Hox (Lab, Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), genes de segmentação (Eve e Wg) e da família Wnt (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). Estes resultados indicam que os mecanismos moleculares em M. olfersii podem ser similares a outros crustáceos estudados. Além disso, parálogos dos genes En (En1 e En2) e Eve (Eve1 e Eve2) foram identificados, sendo que os de Eve foram pela primeira vez identificados em crustáceos. Ainda, isoformas de En (En1a e En1b) e de 4 genes Hox (Dfd1a e Dfd1b, Scr1a e Scr1b, Ubx1a e Ubx1b, AbdA-1a e AbdA-1b) foram identificados provavelmente resultantes de splicing alternativo. Para analisar os níveis de transcritos de genes Hox e de segmentação no desenvolvimento, primeiramente foi avaliada a estabilidade de 6 genes de referência utilizando programas computacionais e qPCR. A expressão dos genes Rpl8 e Rps6 foi mais estável durante o desenvolvimento e nos tecidos de animais adultos, respectivamente. Enquanto que, a expressão dos genes Gapdh e Ef-1a foi menos estável no desenvolvimento. Os genes Rpl8 ou Rps6 e suas combinações são mais indicados para serem utilizados como genes de referência, na análise durante o desenvolvimento, por RT-qPCR. Da análise dos níveis de transcritos de genes relacionados ao desenvolvimento, os transcritos de 3 genes Hox (Lab, Dfd e Ftz) diminuíram com o avanço do desenvolvimento, enquanto que os transcritos de 6 genes Hox (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA e AbdB) aumentaram com o avanço do desenvolvimento, o que estaria relacionado com a função da identidade dos segmentos da cabeça, tórax e abdome. Os genes En1, En2 e Eve2 estariam relacionados com a segmentação, aumentando seus transcritos com a formação de novos segmentos do corpo durante o desenvolvimento. Enquanto que, os transcritos do gene Eve1 diminuíram, o que estaria relacionado com uma função em estágios mais inicias. No entanto, En e Eve também poderiam participar na neurogênese similar a outros artrópodes estudados. Os genes Wg e Hh funcionariam como genes de polaridade segmentar mantendo seus níveis de transcritos similares com o avanço do desenvolvimento. Os níveis de transcritos do gene Dll foi similar entre os estágios e estaria envolvido na formação dos apêndices durante o desenvolvimento como acontece em outros crustáceos. Assim, o presente estudo contribuiu com a primeira identificação em larga escala de transcritos presentes em embriões de M. olfersii, em especial os transcritos de 9 genes Hox e de outros genes relacionados ao desenvolvimento. Além disso, proporciona informação da avaliação de genes de referência para análises de qPCR nesta espécie, que permitirá resultados mais precisos para entender os mecanismos moleculares durante o desenvolvimento embrionário. Da mesma forma, a identificação destas sequências em M. olfersii contribuirá para futuros estudos em diferentes linhas de pesquisa e poderá ainda servir como referência para identificar genes em outros camarões de água doce. <br>

Abstract : Studies of the molecular mechanisms of development in crustaceans are important to understand the morphological diversity of this group. However, few studies have been conducted if we consider the diversity of this group. Among the freshwater prawns, Macrobrachium olfersii emerges as a potential model for development and toxicity studies. However, the molecular mechanisms during development were not described because few sequences are known in this species. In this context, this study had the following objectives: 1) to identify transcripts in order to generate a sequence data bank and contribute to the understanding of the molecular mechanisms in this species, 2) to identify transcripts of gene related to the development, in particular Hox genes and segmentation gene, and 3) analyze the levels of their transcripts during embryonic development of M. olfersii. De novo assembly from 25.6 million reads and transcriptomic analysis of embryos pool (E4-E8) provided 99.751 unigenes. Of the total, 20.95% were similar to sequences of GenBank database. A diversity of transcripts were classified by gene ontology (21.845 unigenes) and 129 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways (6.866 unigenes). The transcripts of genes encoded by mitochondrial DNA (22 tRNA, 2 rRNA and 13 protein-coding genes) were also identified. In the transcriptome analysis using gene ontology, 2,142 unigenes were assigned to the development processes category and 553 unigenes in embryonic development subcategory, whose sequences were more similar to the Zootermopsis nevadensis e Limulus polyphemus arthropods. Furthermore, transcripts of anterior-posterior pattern genes, of dorsal-ventral pattern genes and signaling pathways involved in the development (TGF-ß, Wnt, Notch, MAPK, hedgehog, Jak-STAT VEGF) and ecdysteroid-inducible nuclear receptors were identified. Moreover, by PCR with degenerate primers were identified transcripts of Hox genes (Lab Dfd, Antp, Ubx, AbdA, AbdB), segmentation genes (Eve and Wg) and Wnt family (Wnt2, Wnt4, Wnt5, Wnt7, Wnt11). These results indicate that the molecular mechanisms in M. olfersii could be similar to other crustaceans studied. Moreover, paralogs of genes En (En1 and En2) and Eve (Eve1 and Eve2) were identified, and the Eve paralogs were first identified in crustaceans. In addition, isoforms of En (En1a and En1b) and of 4 Hox genes (Dfd1a and Dfd1b, Scr1a and Scr1b, Ubx1a and Ubx1b, AbdA-1a and AbdA-1b) were identified probably resulting from alternative splicing. To analyze transcript levels of Hox genes and segmentation genes in development, it was first evaluated the expression stability of reference genes using computer programs and qPCR. Expression of Rpl8 and Rps6 genes was more stable embryonic development and in the adult animal tissues, respectively, whereas the expression of Gapdh and Ef-1a genes was less stable in development. Rpl8 and Rps6 genes or its combinations are most appropriate for use as reference gene for RT-qPCR analysis in development. In the analysis of transcript levels of genes related to the development, the transcripts of 3 Hox genes (Lab, Dfd and Ftz) decreased and the transcripts 6 Hox genes (Pb, Scr, Antp, Ubx, AbdA and AbdB) increased its expression with the progress of the development, which is related to its function in the identity of the segments of the head, thorax and abdomen. The genes En1, En2 and Eve2 would be related to the segmentation, increasing its transcripts with formation of new segments of the body during the development. Whereas the transcripts of Eve1 gene decreased that would be related to a function in most early stages. However, En and Eve could also participate in neurogenesis similar to other arthropods studied. The Wg and Hh gene would function as segment polarity genes, maintaining similar their transcript levels with the progress of development. The transcript levels of gene Dll was very similar between the stages and would be involved in the formation of appendages during development as in other crustaceans studied. Thus, this study contributed with the first large-scale identification of transcripts in M. olfersii embryos, in particular transcripts of 9 Hox genes and other genes related to development. It also provides information of the reference genes evaluation for qPCR analysis in this species, allowing more accurate results to understand the molecular mechanisms during embryonic development. In addition, the identification of these sequences in M. olfersii will contribute in future studies in different lines of research and could serve as a reference to identify genes in other freshwater prawns.