Clonagem e expressão heteróloga de transportadores de xilose em linhagem de Saccharomyces cerevisiae recombinante

Abstract

Na produção de etanol de segunda geração o transporte dos açúcares para o interior da levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um passo limitante, principalmente no caso da pentose xilose, o segundo açúcar mais abundante na biomassa lignocelulósica. Para caracterizar o efeito de diferentes transportadores na fermentação de xilose, neste trabalho foi utilizada uma linhagem hxt-null de S. cerevisiae (hxt1-hxt7? e gal2?), mas capaz de metabolizar xilose devido à sobre-expressão dos genes XYL1, XYL2 e XKS1 que codificam as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, respectivamente. Essa linhagem hxt-null foi utilizada para expressar transportadores de S. cerevisiae e de leveduras fermentadoras de xilose Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae e Spathaspora passalidarum. Os resultados indicam que nenhuma das permeases de S. cerevisiae analisadas (Hxt1, Hxt2, Hxt5 e Hxt7) possui propriedades adequadas para captação de xilose, quando esta é a única fonte de carbono ou em misturas de xilose/glicose. Uma biblioteca genômica de S. stipitis foi inserida na linhagem hxt-null, resultando na clonagem de três permeases que realizam o transporte de xilose: o já conhecido transportador Xut1 e duas novas permeases (Hxt2.6 e Qup2) que ainda não tinham sido caracterizadas nessa levedura. No entanto, nenhuma dessas proteínas mostrou-se específica para xilose, pois também captam hexoses presentes no meio. O genoma sequenciado das leveduras S. arborariae e S. passalidarum foi analisado na busca por genes com homologia à transportadores de xilose, e três genes selecionados foram clonados e expressos na linhagem hxt-null. Desses, apenas a permease Sut1 de S. passalidarum realizou transporte de xilose (além de outras hexoses) e, quando o gene HXT4 de S. arborariae era expresso, não houve consumo ou fermentação de nenhum dos açúcares testados. Outra permease dessa levedura (Get1) apresentou uma característica peculiar, ocorrendo a captação de xilose apenas quando maltose ou outras fontes de carbono estavam presentes. Os resultados indicam que a caracterização de novos transportadores de açúcares presentes no genoma de leveduras fermentadoras de xilose é necessária para desenvolver novas estratégias para otimizar a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos por linhagens de S. cerevisiae recombinantes.<br>

Abstract : The internalization of sugars in Saccharomyces cerevisiae during second generation ethanol production is a limiting step, primarily because of xylose, the second most abundant sugar in lignocellulosic biomass. To typify the influence of different transporter in the xylose fermentation, in this work it was used a hxt-null S. cerevisiae strain, deleted in its main hexoses permeases (hxt1-hxt7? e gal2?), but capable of metabolize xylose, due to the overexpression of genes XYL1, XYL2 and XKS1, that code of the enzymes xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase. This hxt-null strain was used to express transporters from the genome of S. cerevisiae and from xylose-fermenting yeasts Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae and Spathaspora passalidarum. The results show that none of the S. cerevisiae permeases analyzed (Hxt1, Hxt2, Hxt5 and Hxt7) had properties suitable for xylose fermentation or xylose/glucose mixtures. In order to obtain new transporters, a genomic library from S. stipitis was transformed into the hxt-null strain, which resulted in cloning three permeases that allowed growth and fermentation of xylose: the already known Xut1, and two new permeases (Hxt2.6 and Qup2) that were not characterized before in this yeast. However, none of these proteins was specific for xylose, since they also allowed efficient fermentation of hexoses in the hxt-null strain. Regarding S. arborariae and S. passalidarum, both yeasts had their genome sequenced and were used to search genes homologues to xylose transporters. Three gene selected were cloned and expressed in the hxt-null S. cerevisiae strain. Of these permeases coded, only Sut1 from S. passalidarum restored xylose (and hexoses) fermentation, and when HXT4 from S. arborariae was expressed, there were no uptake or fermentation of any sugar tested. Another permease from this yeast (Get1) had a peculiar characteristic: it consumed xylose only in co-fermentation, with maltose or other carbon source. The results indicate that the characterization of new sugar transporters present in the genome of xilose-fermenting yeasts is needed to develop new strategies to optimize lignocellulosic hydrolisates fermentations by recombinants S. cerevisiae strains.