Investigação do mecanismo micobactericida da isoniazida em modelo de granuloma humano

Abstract

Após a infecção com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causador da tuberculose (TB), observa-se a formação de uma estrutura celular característica denominada granuloma. Esse agregado celular é responsável por restringir a infecção e manter a doença em estado latente. Porém, quando a forma ativa da doença se desenvolve, o infiltrado de células apresenta necrose caseosa e as bactérias entram em intenso estado replicativo. Diante deste quadro, faz-se uso de antibióticos como a isoniazida (INH), um dos pilares da quimioterapia da TB. A INH é uma pró-droga que requer ativação por uma catalase peroxidase bacteriana codificada pelo gene katG, a fim de inibir a síntese de ácidos micólicos, importantes componentes estruturais da bactéria. Entretanto, dados recentes indicam que a INH pode também ser ativada por enzimas presentes em células do hospedeiro. É possível que este fármaco aja diretamente em células que abrigam o Mtb, contribuindo para o controle do seu crescimento intracelular. Entretanto, estudos que avaliam os efeitos da INH em sistemas biológicos complexos como o granuloma são escassos. Dessa forma, a partir de um modelo de granuloma humano in vitro investigamos os mecanismos iniciais do tratamento com INH que promovem a morte micobacteriana nesse sistema. Nossos resultados demonstram que o modelo utilizado mimetiza a fase ativa da infecção, com populações celulares semelhante às encontradas na infecção in vivo, como macrófagos, células dendriticas, linfócitos e granulócitos. Ainda mais, o granuloma apresenta intensa replicação bacteriana associada à necrose celular. Verificamos ainda que a INH possui capacidade bactericida nesse sistema celular, mas que, ao menos nas fases iniciais de tratamento in vitro, esse efeito não está relacionado com ativação de células T ou monócitos e independe de importantes citocinas, como IL-1ß ou TNF. Utilizando cepas clínicas resistentes à INH, bem como experimentos de coinfecção do granuloma com cepas sensível e resistente à INH, constatamos que o fármaco age diretamente sobre a bactéria, e sua forma ativa não age diretamente nas células do granuloma para promover a morte bacteriana. O desenvolvimento desta tese, em conjunto com outros dados presentes na literatura, confirmou a necessidade de ativação do fármaco pelo patógeno para a atividade inicial bactericida da INH localmente no granuloma.<br>

Abstract : Following infection with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causative agent for tuberculosis (TB), there is formation of a characteristic cellular structure named granuloma. This cellular aggregate is responsible for restricting infection and keeping disease in its latent form. However, when the active disease manifests, the cellular infiltrate undergoes caseous necrosis and bacteria start intense replication. In this scenario, it is initiated the use of antibiotics such as isoniazid (INH), one of the pillars for TB chemotherapy. INH is a pro drug that needs activation by a bacterial catalase peroxidase encoded by katG gene, in order to inhibit mycolic acids synthesis, important bacteria structural components. Nevertheless, recent data indicate that INH can also be activated by cell host enzymes. It is possible that the drug acts directly on host cells infected with Mtb, contributing to the control of intracellular growth. However, studies that evaluate INH s effect in complex biologic systems such as the granuloma are scarce. Therefore, using an in vitro human granuloma model we investigated the early mechanisms by which treatment with INH promotes mycobacterial killing in this system. Our results show that the model mimics the active phase of infection, with the same cellular population seen in in vivo infection, such as macrophages, dendritic cells, lymphocytes and granulocytes. Moreover, the granuloma presents intense bacterial replication associated to cellular necrosis. We could also confirm INH s bactericidal activity in this cellular system, though at least during early in vitro treatment, this effect was not related to T cells or monocytes activation and does not depend on important cytokines, such as IL-1ß or TNF. By using INH resistant clinical strains, as well as performing coinfection experiments with sensible and resistant INH strains, we could confirm the drug s direct action over bacteria, and that its active form does not act directly upon granuloma cells to promote bacterial killing. These thesis conclusions, together with literature data, confirmed the need of pathogen drug activation for early bactericidal activity of INH locally in the granuloma.