Desenvolvimento e aplicação de um sistema celular repórter para herpes simplex virus e padronização de uma PCR quantitativa para poliomavírus BK

Abstract

Pacientes imunodeprimidos podem apresentar infecções virais com evolução rápida, sintomatologias atípicas graves e muitas vezes fatais, sendo fundamental um diagnóstico precoce para estabelecimento do tratamento efetivo, redução da toxicidade e da resistência aos antivirais. HSV-1, HSV-2 e poliomavírus BK são vírus de importância clínica para imunodeprimidos e podem levar a rejeição de órgãos em transplantados. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema celular repórter, utilizando a proteína fluorescente GFP, para HSV-1 e 2 e implantar uma qPCR utilizando amostras clínicas de pacientes transplantados renais para detecção de poliomavírus BK. O sistema celular repórter foi construído através da transfecção de células Vero com o vetor pZsGreen1-1 ligado ao promotor ICP10 (F3R3 e F4R3) da RR1 do HSV-2. A regulação da expressão da GFP via ICP10 é dependente da infecção viral e acontece por meio da proteína viral transativadora VP16 e de fatores celulares Oct-1 e HCF-1. A efetividade do sistema foi avaliada por infecção viral e pela aplicação de antivirais (Aciclovir, ácido gálico, convalotoxina e extrato de Uncaria sp.) e candidatos antivirais inativos (Extrato de Passiflora edulis e derivados de cardenolídeos). O sistema repórter F4R3 ZsGreen1-1 expressou GFP em função da infecção por HSV-1 e 2, a qual foi detectada por microscopia de fluorescência e/ou citometria de fluxo. Em análise por citometria de fluxo, a fluorescência do sistema repórter correlacionou-se diretamente com os títulos virais (MOI de 4,0 x10-3 a 3,3 x10-4, ou seja, 1 partícula viral a cada 250 a 3000 células), o sistema manteve a capacidade de expressão da GFP na presença de agentes sem propriedade antiviral e não expressou fluorescência quando tratado com antivirais. O sistema F4R3 ZsGreen1-1 mostrou-se um sistema funcional com possíveis aplicações para diagnóstico clínico, para elaboração de testes de resistência aos antivirais e para a pesquisa de novos medicamentos. A qPCR para poliomavírus BK foi implantada utilizando amostras de DNA cedidas pelo HEMOSC com iniciadores dirigidos para o antígeno T viral. O limite de detecção foi de 18 cópias genômicas/ reação com quantificações variando entre 9,8 x 105 a 6,7 x 107 cópias genômicas/ mL. A qPCR foi efetiva para análises de amostras clínicas e apresentou limite de detecção suficiente para avaliação de risco de nefropatia em transplantados renais.<br>

Abstract : Immunosuppressed patients can present viral infections with fast evolution, severe atypical symptomatologies and often fatal, being essential the early diagnosis for the establishment of effective treatments, reduction of toxicity and development of resistance to antiviral. HSV-1, HSV-2 and polyomavirus BK are virus of clinical importance for immunosuppresed and can lead to the rejection of transplanted organs. Therefore, the aim of this work was to develop a reporter cellular system, using the fluorescent protein GFP, for HSV-1 and 2, and deploy a qPCR using clinical samples from patients submitted to renal transplant, for the detection of polyomavirus BK. The reporter cellular system was constructed through the transfection of Vero cells with the vector pZsGreen1-1 connected to the promoter ICP10 (F3R3 and F4R3) of the RR1 of the HSV-2. The regulation of the expression of GFP via ICP10 is dependent of the viral infection and happens through the viral transactivating protein VP16, and the cellular factors Oct-1 and HCF-1. The effectivity of the system was evaluated by viral infection and through the application of antiviral (Acyclovir, gallic acid, convalotoxina and extract of Uncaria sp.) and inactive antiviral candidate (Extract of Passiflora edulis and derivatives cardenolide). The reporter system F4R3 ZsGreen1-1 expressed GFP as a function of the infection for HSV-1 and 2, which was detected by fluorescence microscopy and/or flow cytometry. In flow cytometry, the fluorescence of the reporter system was directly correlated with virus titers (MOI 4,0 x10-3 to 3,3 x10-4, that is, 1 viral particle to each 250 to 3000 cells), the system maintained the ability to GFP expression in the presence of agents without antiviral property and no expressed fluorescence when treated with antivirals. The system F4R3 ZsGreen1-1 revealed a functional system with possible applications for clinical diagnosis, elaboration of tests of resistance to the antiviral and for new drugs research. The qPCR to polyomavirus BK was deployed using DNA samples provided by HEMOSC with primers directed to the viral antigen T. The limit of detection was 18 genome copies /reaction with quantification ranging between 9.8 x 105 to 6.7 x 107 genome copies /mL. The qPCR was effective for the analyses of clinical samples and presented enough sensitivity for risk evaluation of nephropathy in renal transplant.