Estudo do efeito anti-inflamatório da Esenbeckia leiocarpa Engl. no modelo da pleurisia induzida pela carragenina em camundongos

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Estudo do efeito anti-inflamatório da Esenbeckia leiocarpa Engl. no modelo da pleurisia induzida pela carragenina em camundongos

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Título: Estudo do efeito anti-inflamatório da Esenbeckia leiocarpa Engl. no modelo da pleurisia induzida pela carragenina em camundongos
Autor: Pozzatti, Patrícia
Resumo: Introdução: O gênero Esenbeckia (Rutaceae) compreende aproximadamente 30 espécies identificadas, nativas de regiões tropicais, tais como México e Brasil, incluindo principalmente os Estados brasileiros de São Paulo, Bahia, Minas Gerias, Goiás e Mato Grosso do Sul. Estudos in vivo e in vitro demonstraram que plantas deste gênero apresentam propriedades anti-inflamatórias. Objetivos: Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato bruto hidroalcoólico (EBH), frações e compostos isolados da Esenbeckia leiocarpa Engl., administrada por via intraperitoneal (i.p.), no modelo da pleurisia induzida pela carragenina em camundongos. Metodologia: As cascas secas da E. leiocarpa Engl. foram maceradas e extraídas com etanol para obter o EBH. A partir deste extrato, foram obtidas as frações n-hexano (Hex), acetato de etila (AcOEt), aquosa (Aq) e alcaloídica (Alc), sendo que esta última fração foi extraída com éter etílico originando duas subfrações: uma alcaloídica polar (AlcP) e outra apolar (AlcAp). O composto majoritário, o alcaloide indólico dihidrocorinanteol (DHC), foi isolado da subfração AlcAp. No protocolo para identificar e elucidar a estrutura do composto majoritário presente na E. leiocarpa Engl., foram utilizadas análises de eletroforese capilar, características físicas, infravermelho, ressonância magnética nuclear (RMN de 1H e 13C) e espectrometria de massas. Em outro protocolo, o composto isolado identificado foi modificado por reações de substituição nucleofílica, originando os análogos acetil, p-metil, benzoil, p-metoxi e p-cloro, que foram utilizados em um estudo de relação estrutura-atividade, avaliando-se o efeito destes compostos sobre leucócitos, exsudação e atividade da enzima mieloperoxidase (MPO). No modelo da pleurisia induzida pela carragenina, foram utilizados camundongos albinos Swiss e foram avaliados os seguintes parâmetros inflamatórios no lavado da cavidade pleural: leucócitos, exsudação, atividades das enzimas MPO e adenosina-deaminase (ADA), e as concentrações de nitrito/nitrato (NOx), interleucina 1-beta (IL-1?) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-?). Neste estudo, diferentes grupos de animais foram tratados com EBH (10 - 100 mg/kg), Hex (10 - 50 mg/kg), AcOEt (10 - 50 mg/kg), Aq (2 - 10 mg/kg), Alc (1 - 10 mg/kg), AlcP (0,5 - 5 mg/kg), AclAp (0,1 - 2 mg/kg) ou DHC (0,1 - 0,5 mg/kg), administrados (i.p.) 0,5 h antes da carragenina (1%) administrada por via intrapleural (i.pl.). Os parâmetros inflamatórios foram avaliados 4 h após. Para avaliar a exsudação, os animais foram tratados previamente com solução Azul de Evans (25 mg/kg, i.v.). Diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas pela análise dos testes de variância (ANOVA), Newman-Keuls e/ou t de Student. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. Além disso, realizou-se também o estudo de toxicidade do EBH por meio da análise da curva de sobrevida. Neste estudo, diferentes grupos de animais receberam diferentes doses do EBH (250 mg/kg, 500 mg/kg e 1000 mg/kg, i.p.) e o número de óbitos foi observado diariamente, durante dez dias. Resultados: EBH da E. leiocarpa Engl. (25 - 100 mg/kg), Hex (25 - 50 mg/kg), AcOEt (25 - 50 mg/kg), Aq (5 - 10 mg/kg), Alc (5 - 10 mg/kg), AlcP (1 - 5 mg/kg), AlcAp (0,5 - 2 mg/kg) e DHC (0,25 - 0,5 mg/kg) inibiram: leucócitos, neutrófilos, mononucleares e exsudação (P < 0,05). Da mesma forma, EBH (25 mg/kg), Hex (50 mg/kg), AcOEt (50 mg/kg), Aq (5 ou 10 mg/kg), Alc (10 mg/kg), AlcP (1 ou 2 mg/kg), AlcAp (0,5 mg/kg) e DHC (0,25 mg/kg) inibiram as atividades das enzimas MPO e ADA, além das concentrações de NOx, IL-1? e TNF-? (P < 0,05). Em relação à toxicidade, observou-se que a dose de 250 mg/kg demonstrou-se segura, pois resultou em 100% de sobrevida dos animais após 10 dias de observação, enquanto que nas doses de 500 e 1000 mg/kg todos os animais morreram no primeiro dia. Observou-se também que o composto DHC apresentou melhor efeito anti-inflamatório do que seus análogos: acetil, p-metil, benzoil, p-metoxi e p-cloro, uma vez que somente o DHC inibiu ambos os parâmetros inflamatórios estudados: leucócitos e exsudação (P < 0,01). Além disso, os análogos do DHC inibiram a atividade da MPO (P < 0,01). Conclusões: Os resultados demonstraram que: 1) E. leiocarpa Engl. possui importante atividade anti-inflamatória; 2) este efeito ocorre principalmente em relação à inibição da migração leucocitária e da exsudação; 3) a inibição destes parâmetros inflamatórios está relacionada também à inibição de NOx, IL-1? e TNF-?; 4) a inibição da atividade da MPO e ADA está relacionada a diminuição de leucócitos ativados; 5) as doses utilizadas nos experimentos parecem ser seguras; 6) o DHC foi mais efetivo do que os seus análogos neste modelo de inflamação, e as alterações físico-químicas promovidas no DHC, após a inserção dos substituintes acetil, p-metilbenzoil, benzoil, p-metoxibenzoil e p-clorobenzoil na hidroxila do carbono 17, determinam a efetividade do efeito anti-inflamatório.<br>Abstract : Introduction: Esenbeckia genus (Rutaceae) includes approximately 30 species native from tropical regions such as Mexico and Brazil, mainly in the Brazilian states of Sao Paulo, Bahia, Minas Gerais, Goias and Mato Grosso do Sul. Studies using in vivo and in vitro models have demonstrated that plants of this genus have anti-inflammatory properties. Objectives: To evaluate the anti-inflammatory effect of the crude hydroalcoholic extract (CHE), fractions and compounds isolated from Esenbeckia leiocarpa Engl., administered intraperitoneally (i.p.) in the carrageenan-induced murine model of pleurisy. Methodology: The dried E. leiocarpa Engl. bark was macerated and extracted with ethanol to obtain the CHE. The n-hexane (Hex), ethyl acetate (AcOEt), aqueous (Aq) and alkaloids (Alk) fractions were obtained from CHE, and two alkaloid subfractions, polar (polar Alk) and nonpolar (nonpolar Alk) were obtained from the Alk fraction using an ethyl ether extraction. The major compound, the indole alkaloid dihydrocorinantheol (DHC) was isolated from nonpolar Alk subfraction. Analysis of capillary electrophoresis, physical characteristics, infrared, nuclear magnetic resonance (1H and 13C NMR) and mass spectrometry were used to identify and elucidate the structure of the major compound present in the E. leiocarpa Engl. In another protocol, the isolated compound was subjected to chemical structural modifications by nucleophilic substitution reactions to develop the acetyl, p-methyl, benzoyl, p-methoxy and p-chloro analogs, which were used in a study of structure-activity relationships to evaluate the effect of these compounds upon leucocytes and exudation concentrations and myeloperoxidase (MPO) activity. Swiss mice were used in the carrageenan-induced murine model of pleurisy and the following inflammatory parameters were evaluated the fluid of the pleural cavity: leukocytes, exudation, MPO and adenosine deaminase (ADA) activities, and the concentrations of nitrite/nitrate (NOx), interleukin-1 beta (IL-1â) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-á). In this study, different groups of animals were pretreated with CHE (10 - 100 mg/kg), Hex (10 - 50 mg/kg), AcOEt (10 - 50 mg/kg), Aq (2 - 10 mg/kg), Alk (1 - 10 mg/kg), polar Alk (0.5 - 5 mg/kg), nonpolar Alk (0.1 - 2 mg/kg) or DHC (0.1 - 0.5 mg/kg) administered (i.p.) 0.5 h before carrageenan (1%) which was administered by intrapleural route (i.pl.). The inflammatory parameters were evaluated after 4 h. To evaluate the exudation, the animals were pretreated with Evans blue dye (25 mg/kg, i.v.). Statistical differences between groups were determined by analysis of variance test (ANOVA), Newman-Keuls and/or Student#s t test. P < 0.05 was considered significant. Further, the toxicity study of CHE we performed by analyzing the survival curve. In this study, different groups of animals received different doses of EBH (250 mg/kg, 500 mg/kg and 1000 mg/kg, i.p.) and the number of deaths was observed daily for 10 days. Results: CHE (25 - 100 mg/kg), Hex (25 - 50 mg/kg), AcOEt (25 - 50 mg/kg), Aq (5 - 10 mg/kg), Alk (5 - 10 mg/kg), polar Alk (1 - 5 mg/kg), nonpolar Alk (0.5 - 2 mg/kg) and DHC (0.25 - 0.5 mg/kg) inhibited leukocytes, neutrophils, mononuclears and exudation (P < 0.05). Also, CHE (25 mg/kg), Hex (50 mg/kg), AcOEt (50 mg/kg), Aq (5 or 10 mg/kg), Alc (10 mg/kg), polar Alk (1 or 2 mg/kg), nonpolar Alk (0.5 mg/kg) and DHC (0.25 mg/kg) inhibited the MPO and ADA activities, and the concentrations of NOx, IL-1â and TNF-á (P < 0.05). In relation to toxicity, it was observed that the dose of 250 mg/kg of CHE was safe because its administration resulted in 100% survival of the animals after 10 days, whereas at the doses of 500 mg/kg and 1000 mg/kg all animals died in the first day of observation. Furthermore, the DHC alkaloid showed better anti-inflammatory effect than its analogs: acetyl, p-methyl, benzoyl, p-methoxy and p-chloro, because only the DHC inhibits both studied inflammatory parameters: leukocytes and exudation concentrations (P < 0.01). Further, the DHC analogs inhibited MPO activity (P < 0.01). Conclusions: The results showed that: 1) E. leiocarpa Engl. has important anti-inflammatory activity; 2) this effect occurs mainly in relation to inhibition of leukocyte migration and exudation concentrations; 3) the Inhibition of these inflammatory parameters is also related to NOx, IL-1â and TNF-á inhibition; 4) the inhibition of MPO and ADA activities are associated with decrease of activated leukocytes; 5) the doses used in the experiments of this study appear to be safe; 6) DHC was more effective than its analogs in this model of inflammation, and the physicochemical modifications in the DHC after insertion of the acetyl, p-methylbenzoyl, benzoyl, p-methoxybenzoyl and p-chlorobenzoyl substituents radicals on the hydroxyl group at carbon 17 determine the effectiveness of the anti-inflammatory action.
Descrição: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2012
URI: http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/100967
Data: 2013-06-26


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