https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/92309 2026-10-20T13:09:12Z 2026-10-20T13:09:12Z SIlva, Maria Isabelly Limeira de Sousa https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/276560 2026-09-15T23:28:48Z 2026-01-01T00:00:00Z

Exposição de células microgliais BV2 ao lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) como um modelo de neuroinflamação e avaliação de efeito protetor por guanosina SIlva, Maria Isabelly Limeira de Sousa A neuroinflamação constitui um processo central na fisiopatologia de diversas doenças tanto infecciosas como neurodegenerativas, sendo as células da micróglia as principais responsáveis pela resposta imune no sistema nervoso central (SNC). Estímulos inflamatórios induzem a ativação da micróglia, que promove a liberação de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, além de desencadear alterações metabólicas e mitocondriais que contribuem para o dano neuronal. Nesse contexto, compostos com propriedades neuroprotetoras têm sido investigados como potenciais moduladores da resposta neuroinflamatória. A guanosina (GUO), um nucleosídeo endógeno do sistema purinérgico, apresenta efeitos neuroprotetores descritos em diferentes modelos experimentais; entretanto, seu papel na modulação da resposta inflamatória na micróglia ainda não foi avaliado. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da GUO sobre alterações inflamatórias e metabólicas induzidas pelo lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) em células da linhagem de micróglia BV2. Para isso, as células foram tratadas com LPS (0,5 ou 1 µg/mL) na presença ou ausência de GUO (100 µM, ou curva de concentração de 30 a 500 µM), sendo avaliados parâmetros associados à ativação microglial, incluindo viabilidade celular, produção de NO, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial, alterações morfológicas, produção da citocina pró-inflamatória TNF-a e imunofenotipagem por citometria de fluxo. Os resultados mostram que o tratamento com LPS promoveu aumento significativo da produção de mediadores inflamatórios, incluindo nitrito e TNF-a, aumento da frequência de células CD86?, redução da viabilidade celular e alterações morfológicas compatíveis com ativação microglial. O tratamento com GUO reduziu a produção de nitrito, atenuou as alterações morfológicas induzidas por LPS e preveniu parcialmente o declínio do potencial de membrana mitocondrial. Esses resultados sugerem um possível efeito modulador da guanosina sobre a resposta inflamatória microglial. Em conjunto, os achados reforçam a importância do sistema purinérgico na regulação da neuroinflamação e indicam a guanosina como uma molécula promissora na modulação de processos inflamatórios no SNC.; Abstract: Neuroinflammation is a central process in the pathophysiology of several infectious and neurodegenerative diseases, with microglial cells being the main mediators of the immune response in the central nervous system (CNS). Inflammatory stimuli induce microglial activation, leading to the release of pro-inflammatory cytokines and reactive oxygen and nitrogen species, as well as metabolic and mitochondrial alterations that contribute to neuronal damage. In this context, compounds with neuroprotective properties have been investigated as potential modulators of the neuroinflammatory response. Guanosine (GUO), an endogenous nucleoside of the purinergic system, has shown neuroprotective effects in different experimental models; however, its role in modulating the inflammatory response in micróglia has not yet been fully investigated. The present study aimed to evaluate the effects of GUO on inflammatory and metabolic alterations induced by bacterial lipopolysaccharide (LPS) in BV2 microglial cells. For this purpose, cells were treated with LPS (0.5 or 1 µg/mL) in the presence or absence of GUO (100 µM, or a concentration?response curve ranging from 30 to 500 µM). Parameters associated with microglial activation were evaluated, including cell viability, NO production, reactive oxygen species (ROS) generation, mitochondrial membrane potential, morphological alterations, production of the pro-inflammatory cytokine TNF-a, and immunophenotyping by flow cytometry. The results showed that LPS treatment significantly increased the production of inflammatory mediators, including nitrite and TNF-a, increased the frequency of CD86? cells, reduced cell viability, and induced morphological alterations consistent with microglial activation. Treatment with GUO reduced nitrite production, attenuated the morphological alterations induced by LPS, and partially prevented the decline in mitochondrial membrane potential. These findings suggest a potential modulatory effect of guanosine on the microglial inflammatory response. Taken together, the results reinforce the importance of the purinergic system in the regulation of neuroinflammation and indicate guanosine as a promising molecule for modulating inflammatory processes in the CNS. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2026.

2026-01-01T00:00:00Z Cunha, César https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/276449 2026-09-14T23:30:03Z 2026-01-01T00:00:00Z

Análise computacional de possíveis sítios ativos extracelulares no canal de potássio BK: comparação entre o ligante sintético ctibd e a guanosina Cunha, César A guanosina (GUO) é uma molécula endógena da classe das purinas com efeitos neuroprotetores demonstrados em modelos de patologias in vivo e in vitro. Porém seu mecanismo de ação ainda não está completamente elucidado. Embora saiba-se do envolvimento dos receptores de adenosina, diversos efeitos neuroprotetores da GUO são revertidos ao bloquear o canal de potássio de alta condutância dependente de voltagem e cálcio (BK). Além disso, a adição de GUO no meio extracelular leva a abertura do canal. O BK é formado por um tetrâmero de subunidades-a podendo ou não possuir subunidades auxiliares ß ou ?. O canal é modulado por diversas moléculas que interagem no meio intracelular ou na parcela transmembrana; porém apenas os sítios de interação conhecidos para o ativador sintético 4-(4-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)isoxazol-5-il)benzeno-1,3-diol (CTIBD) são acessíveis pelo meio extracelular. Desta forma, este trabalho buscou analisar possíveis sítios de interação para GUO no BK por técnicas in silico. Para isso foram identificadas cavidades hidrofóbicas na parcela extracelular do canal BK, analisada a interação da GUO nestas cavidades por molecular docking e escolhida uma cavidade mais provável para ser o sítio de interação da GUO. Depois foi montado o complexo GUO-BK in silico inserido em uma membrana e solvatado em água e íons, com base em uma estrutura tridimensional do BK predita a partir da sequência aminoacídica. Como a cavidade escolhida coincidia com um dos sítios para o CTIBD, também foram feitas as mesmas análises com ele e ambas foram comparadas entre si. Foram encontradas 8 cavidades hidrofóbicas acessíveis pelo meio extracelular, e a mais provável foi escolhida com base na estrutura da cavidade, nos resultados do molecular docking, e na literatura. A GUO e o CTIBD foram posicionados na região desta cavidade e foram simulados os complexos BK-ligantes por 100 ns. Com base na trajetória resultante, foi identificado que ambos os ligantes permanecem dentro do sítio de interação ao longo dos 100 ns em todas as amostras. Também foram identificados os resíduos Gly18, Arg20, Trp22, Ser260, Gly261 e Phe267 como os mais importantes e mais prováveis de estarem envolvidos na interação do BK com a GUO ou com o CTIBD, através do cálculo do tempo de interação entre estes resíduos e os ligantes, chamada ocupância. Foi calculada a entalpia da interação do BK com os ligantes, com média de -13,9637 ± 4,2414 kcal/mol para o CTIBD e -14,6903 ± 3,2349 kcal/mol para a GUO, indicando afinidade semelhante do BK pelos ligantes. Os resíduos encontrados neste estudo já estão identificados na literatura como envolvidos na interação entre o BK e o CTIBD, assim, podem ser alvos de estudos futuros que busquem confirmar os resultados encontrados neste trabalho. Concluí-se, então, que a GUO possivelmente interage com o canal BK por meio do principal sítio de interação já conhecido como o sítio de interação para o CTIBD, envolvendo vários dos mesmos aminoácidos.; Abstract: Guanosine (GUO) is an endogenous molecule belonging to the purine class, with neuroprotective effects demonstrated in vivo and in vitro models of pathological conditions. However, its mechanism of action is not yet fully elucidated. Although the involvement of adenosine receptors is recognized, several neuroprotective effects of GUO are reversed when the large-conductance voltage- and calcium-activated potassium channel (BK) is blocked. Furthermore, the addition of GUO in the extracellular medium leads to channel opening. The BK channel is formed by a tetramer of a-subunits and may or may not include auxiliary ß or ? subunits; The channel is modulated by various molecules that interact within the intracellular environment or the transmembrane region; however only the interaction sites for 4-(4-(4-chlorophenyl)-3-(trifluoromethyl)isoxazol-5-yl)benzene-1,3-diol (CTIBD), a synthetic BK activator, are accessible from the extracellular medium. Thus, this study aimed to analyze potential GUO interaction sites on the BK channel using in silico approaches. Hydrophobic cavities in the extracellular medium portion of the BK channel were identified and GUO interaction within these cavities were evaluated through molecular docking. A cavity with the highest likelihood of being the GUO interaction site was then selected. Subsequently, the in silico GUO-BK complex was constructed, embedded in a membrane and solvated with water and ions, based on a three-dimensional BK structure predicted from its amino acid sequence. Since the selected cavity coincided with one of the known CTIBD binding sites, the same analyses were also performed for CTIBD and both ligands were compared. A total of eight hydrophobic cavities accessible from the extracellular environment were identified and the most plausible site was selected based on cavity structure, molecular docking results and literature evidence, GUO and CTIBD were positioned within this cavity region and the BK-ligand complexes were simulated for 100 ns in all samples. Residues Gly18, Arg20, Trp22, Ser260, Gly261 and Phe267 were identified as the most important and most likely to be involved in interactions with GUO or CTIBD, based on interaction time calculation (occupancy) between these residues and the ligands. The interaction enthalpy between BK and the ligands was also calculated, yielding average values of -13,9637 ± 4,2414 kcal/mol for CTIBD and -14,6903 ± 3,2349 kcal/mol for GUO, indicating similar affinity of BK for both ligands. The residues found in this study have already been reported in the literature as involved in BK-CTIBD interactions and may, therefore, serve as targets for future studies aimed at validating the findings of this work. In conclusion, GUO likely interact with the BK channel through the principal interaction site already described for CTIBD, involving several of the same amino acid residues. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2026.

2026-01-01T00:00:00Z Ibrahim, Samira Pietrobom https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/276442 2026-09-14T23:29:56Z 2026-01-01T00:00:00Z

A importância da membrana peritrófica na organização da digestão nas larvas dos carunchos pragas de feijão Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus Ibrahim, Samira Pietrobom A organização da digestão em insetos-praga de feijão, como os carunchos (bruquíneos) Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, permanece incompletamente compreendida, especialmente quanto à presença da membrana peritrófica (MP) no intestino-médio (IM). Em outros insetos, a MP está associada à organização do lúmen intestinal, compartimentalização da digestão e proteção do epitélio. Esta tese investigou a ocorrência da MP em larvas dessas espécies e sua contribuição para a compartimentalização da atividade enzimática, o transporte de água e a organização funcional do IM. Foram realizados ensaios biológicos com fluoróforos ligantes de quitina, análises histoquímicas, microscopia de luz e eletrônica de transmissão e de varredura, ensaios enzimáticos e análise transcriptômica. A MP foi identificada na região posterior do IM por meio de marcação com calcofluor e lectina de trigo acoplada à fluoresceína isotiocianato (WGA-FITC), além da observação de uma estrutura lamelar característica em cortes histológicos analisados por microscopia de luz. Essas evidências foram obtidas em ambas as espécies analisadas, enquanto experimentos fisiológicos e análises transcriptômicas foram conduzidos principalmente em larvas de Z. subfasciatus. Também foi evidenciada a presença de muco revestindo o epitélio ao longo de todo o IM. A análise transcriptômica revelou maior expressão de genes relacionados à síntese da MP na região posterior do IM, enquanto genes associados a mucinas apresentaram expressão ao longo de todo o órgão. Embora a a-amilase seja discretamente mais expressa na região anterior do IM, os ensaios enzimáticos demonstraram maior atividade na região média, sugerindo redistribuição das enzimas ao longo do lúmen intestinal e concentração funcional próxima ao início da MP, compatível com o modelo de reciclagem enzimática mediado por contrafluxo. A administração de furosemida alterou a distribuição espacial da atividade enzimática, indicando que transportadores de íons e água participam da manutenção dos fluxos luminais que sustentam a circulação endoectoperitrófica e, consequentemente, da reciclagem enzimática. Adicionalmente, as atividades de a-amilase medidas em larvas alimentadas com amido de batata evidenciaram o deslocamento dessas enzimas ao longo do IM, indicando maior evacuação enzimática quando saturadas pelo substrato, o que reforça a dinâmica de circulação luminal associada à reciclagem enzimática. Diferenças ultraestruturais entre regiões do IM evidenciaram áreas predominantemente secretoras e absortivas, corroborando a existência de compartimentalização funcional. Os resultados demonstram que a MP, embora restrita à porção posterior do IM, exerce papel relevante na organização espacial da digestão, contribuindo para a proteção epitelial e para a eficiência do processo digestivo. Em conjunto, os resultados indicam que a digestão nesses insetos envolve a compartimentalização em espaços endoperitrófico e ectoperitrófico e a circulação endoectoperitrófica em uma região definida do IM. Paralelamente, uma camada contínua de muco reveste todo o epitélio intestinal, inclusive nas regiões onde a MP está presente, assegurando proteção epitelial ao longo do órgão. Esses achados esclarecem a organização digestiva em bruquíneos ao demonstrar que a MP é regionalizada e funcionalmente integrada à circulação endoectoperitrófica e à reciclagem de enzimas digestivas, enquanto uma camada mucosa contínua reveste todo o IM e contribui para a proteção do epitélio intestinal. Além de ampliar o entendimento da fisiologia molecular da digestão em bruquíneos, esses resultados fornecem base para investigações sobre mecanismos de adaptação alimentar e interação inseto-semente, podendo também subsidiar estratégias de controle direcionadas a processos digestivos e componentes da barreira intestinal.; Abstract: The organization of digestion in bean weevils such as Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus remains incompletely understood, particularly regarding the occurrence of the peritrophic membrane (PM) in the midgut. In other insects, the PM is associated with luminal organization, compartmentalization of digestion, and epithelial protection. This thesis investigated the occurrence of the PM in larvae of these species and its contribution to the compartmentalization of enzymatic activity, water transport, and functional organization of the midgut. Biological assays using chitin-binding fluorophores, histochemical analyses, light microscopy, transmission and scanning electron microscopy, enzymatic assays, and transcriptomic analyses were performed. The PM was identified in the posterior region of the midgut lumen through calcofluor staining and fluorescein isothiocyanate-conjugated wheat germ agglutinin (WGA-FITC), as well as by the observation of a characteristic lamellar structure in histological sections analyzed by light microscopy. This evidence was obtained in both species, whereas physiological experiments and transcriptomic analyses were conducted mainly in Z. subfasciatus larvae. The presence of a mucus layer lining the epithelium throughout the midgut was also demonstrated. Transcriptomic analyses revealed higher expression of genes related to PM synthesis in the posterior region of the midgut, whereas genes associated with mucins were expressed throughout the organ. Although a-amylase transcripts were slightly more abundant in the anterior region of the midgut, enzymatic assays demonstrated higher activity in the middle region, suggesting redistribution of enzymes along the gut lumen and functional concentration near the beginning of the PM, consistent with the counterflow-mediated enzyme recycling model. Administration of furosemide altered the spatial distribution of enzymatic activity, indicating that ion and water transporters participate in maintaining luminal flows that support endoectoperitrophic circulation and, consequently, enzyme recycling. In addition, measurements of a-amylase activity in larvae fed potato starch showed displacement of these enzymes along the midgut lumen, indicating increased enzyme flow when saturated with substrate and reinforcing the existence of luminal circulation dynamics associated with enzyme recycling. Ultrastructural differences among midgut regions revealed predominantly secretory and absorptive areas, corroborating the existence of functional compartmentalization. The results demonstrate that the PM, although restricted to the posterior portion of the midgut, plays a relevant role in the spatial organization of digestion, contributing to epithelial protection and digestive efficiency. Taken together, the results indicate that digestion in these insects involves compartmentalization into endoperitrophic and ectoperitrophic spaces, as well as endoectoperitrophic circulation within a defined region of the midgut. Simultaneously, a continuous mucus layer lines the entire intestinal epithelium, including regions where the PM is present, ensuring epithelial protection throughout the organ. These findings elucidate digestive organization in bruchids by demonstrating that the PM is regionalized and functionally integrated with endoectoperitrophic circulation and digestive enzyme recycling, while a continuous mucus layer contributes to the protection of the intestinal epithelium throughout the midgut. In addition to broadening the understanding of digestive physiology in bruchids, these results provide a basis for future investigations into mechanisms of dietary adaptation and insect-seed interactions, and may also support the development of control strategies targeting digestive processes and components of the intestinal barrier. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2026.

2026-01-01T00:00:00Z Gessler, Karen Beatriz https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/275500 2026-09-08T23:33:45Z 2026-01-01T00:00:00Z

Estudo do efeito neuroprotetor da Atorvastatina em um modelo pré-clínico da Doença de Alzheimer Gessler, Karen Beatriz A Doença de Alzheimer (DA) é uma enfermidade neurodegenerativa caracterizada por prejuízo cognitivo progressivo, alterações comportamentais e disfunções celulares associadas, incluindo o comprometimento da função mitocondrial. Apesar dos avanços no entendimento de sua fisiopatologia, as opções terapêuticas disponíveis permanecem limitadas e incapazes de impedir a progressão da doença. Evidências experimentais indicam que a atorvastatina apresenta efeitos pleiotrópicos, incluindo propriedades anti-inflamatórias e neuroprotetoras. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da atorvastatina em um modelo murino de DA induzido pela infusão intracerebroventricular (i.c.v.) do peptídeo beta-amiloide Aß1- 42. Inicialmente, camundongos machos foram tratados com atorvastatina (10 mg/kg, via oral, por 7 dias) e avaliados quanto à viabilidade celular, integridade de membrana, produção de espécies reativas de oxigênio, potencial de membrana mitocondrial, bioenergética mitocondrial por respirometria de alta resolução e atividade dos complexos mitocondriais I e II no córtex pré-frontal, considerando que estudos prévios já haviam feito essas avaliações no hipocampo. A administração de atorvastatina per se não promoveu alterações nos parâmetros celulares, mitocondriais ou bioenergéticos avaliados, indicando ausência de efeito tóxico sobre o córtex pré- frontal cerebral. Em continuação, utilizamos um modelo pré-clínico da DA que avalia a toxicidade do peptídeo beta-amiloide (Aß1-42). A infusão i.c.v. de Aß1-42 (70 pmol/sítio, 3 uL) induziu dano celular significativo em fatias hipocampais, evidenciado por aumento da permeabilidade de membrana, sem alterações relevantes no córtex pré- frontal. Do ponto de vista comportamental, déficit cognitivo foi observado apenas 30 dias após a infusão (sem efeito aos 10 e 14 dias), com prejuízo na memória de curto prazo na tarefa de reconhecimento de objetos. O tratamento com atorvastatina preveniu o dano celular no hipocampo e não alterou significativamente o déficit de memória de curto prazo induzido pelo Aß1-42. A análise da função mitocondrial revelou que a infusão de Aß1-42 promoveu aumento na atividade do complexo mitocondrial I (sem alteração no complexo II), particularmente no hipocampo, indicando comprometimento da cadeia respiratória mitocondrial. O tratamento com atorvastatina atenuou o aumento da atividade do complexo I. Em conjunto, os resultados demonstram que a atorvastatina não apresenta efeito tóxico per se para o córtex pré- frontal, conforme já demonstrado para o hipocampo. A infusão de Aß1-42 (70 pmol/sítio, i.c.v.) demonstra toxicidade às fatias hipocampais e não corticais e a atorvastatina exerce efeito neuroprotetor frente à toxicidade induzida pelo Aß1-42 no hipocampo, reduzindo a permeabilização da membrana celular e atuando na preservação da função mitocondrial. Não foi observado efeito significativo da atorvastatina sobre o prejuízo de memória de curto prazo em camundongos. Esses resultados confirmam o efeito neuroprotetor da atorvastatina frente à neurotoxicidade induzida pelo peptídeo Aß1-42.; Abstract: Alzheimer?s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive cognitive decline, behavioral disturbances, and cellular dysfunctions, including mitochondrial impairment. Despite advances in understanding its pathophysiology, currently available therapeutic approaches remain limited and ineffective in halting disease progression. Experimental evidence suggests that atorvastatin exerts pleiotropic effects, including anti-inflammatory and neuroprotective properties. In this context, the present study aimed to investigate the effects of atorvastatin in a murine model of AD induced by intracerebroventricular (i.c.v.) infusion of the amyloid-beta peptide Aß1?42. Initially, male mice were treated with atorvastatin (10 mg/kg, orally, for 7 days) and evaluated for cellular viability, membrane integrity, reactive oxygen species production, mitochondrial membrane potential, mitochondrial bioenergetics by high-resolution respirometry, and mitochondrial complexes I and II activities in the prefrontal cortex, considering that previous studies had already investigated these parameters in the hippocampus. Atorvastatin administration per se did not induce alterations in any cellular, mitochondrial, or bioenergetic parameters assessed, indicating the absence of toxic effects in the prefrontal cortex. Subsequently, a preclinical AD model based on Aß1?42 toxicity was employed. Intracerebroventricular infusion of Aß1?42 (70 pmol/site, 3 µL) induced significant cellular damage in hippocampal slices, evidenced by increased membrane permeability, whereas no relevant alterations were observed in the prefrontal cortex. From a behavioral perspective, cognitive impairment was detected only 30 days after infusion, with no effects observed at 10 or 14 days, as demonstrated by deficits in short-term memory in the novel object recognition task. Atorvastatin treatment prevented hippocampal cellular damage but did not significantly reverse the Aß1?42-induced short-term memory impairment. Mitochondrial function analysis revealed that Aß1?42 infusion increased mitochondrial complex I activity, without affecting complex II activity, particularly in the hippocampus, indicating disruption of the mitochondrial respiratory chain. Atorvastatin treatment attenuated the increase in complex I activity. Collectively, these findings demonstrate that atorvastatin does not exert toxic effects per se in the prefrontal cortex, corroborating previous observations in the hippocampus. Furthermore, Aß1?42 infusion (70 pmol/site, i.c.v.) induces selective hippocampal toxicity, while atorvastatin exerts neuroprotective effects against Aß1?42-induced neurotoxicity by reducing membrane permeabilization and preserving mitochondrial function. However, no significant effect of atorvastatin on short-term memory impairment was observed. Overall, these results reinforce the neuroprotective potential of atorvastatin against Aß1?42-induced neurotoxicity. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2026.

2026-01-01T00:00:00Z