Desenvolvimento de uma nanopartícula conjugada com anticorpo anti-TROP para carreamento de sistemas CRISPR-Cas9 em câncer

Abstract

O câncer é um importante problema de saúde pública, e a resistência às terapias disponíveis reforça a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, a edição gênica por CRISPR-Cas9 apresenta potencial para o tratamento do câncer, porém sua aplicação in vivo é limitada pela dificuldade de entrega e direcionamento dos componentes de edição. As nanopartículas lipídicas (NPLs) funcionalizadas com anticorpo apresentam-se como uma plataforma nanocarreadora promissora para a entrega direcionada desses sistemas, contudo a purificação das NPLs se faz necessária, a fim de retirar intermediários potencialmente tóxicos formados durante a reação de conjugação. Durante o período de vigência da bolsa de Iniciação Científica, foram desenvolvidas atividades com o objetivo de padronizar uma metodologia de purificação de NPLs funcionalizadas com anticorpos. A formulação NPL3, contendo pMax ou PX458 foi submetida a conjugação de anticorpo por meio de reação química, usando EDC e sulfo-NHS e purificada através de uma coluna de sepharose CL-4B. As frações obtidas foram caracterizadas por DLS quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersão (PdI) e potencial zeta, e por Western blotting para identificação e quantificação do anticorpo. A densidade celular foi analisada pelo ensaio de SRB, enquanto a entrega do pDNA foi avaliada por microscopia de fluorescência, utilizando a expressão de GFP como marcador. A caracterização das frações permitiu identificar a fração 3 (FR3) como a mais representativa da NPL3, apresentando características físico-químicas compatíveis ao perfil da NPL3 e taxa de acoplamento de anticorpo detectável por Western blotting, sendo essa fração a mais adequada para um produto nanotecnológico. A FR3 não reduziu significativamente a densidade celular nas linhagens avaliadas, diferentemente das formulações não purificadas, demonstradas anteriormente. Além disso, a expressão de GFP nas células B16F10 e MCF7 indica a manutenção da capacidade de entrega intracelular do pDNA após a purificação. Conclui-se que a cromatografia em Sepharose CL-4B foi adequada para a purificação das NPLs funcionalizadas, com a FR3 apresentando preservação das características da formulação e redução da toxicidade associada à conjugação.