Micronization of apigenin with supercritical CO2: characterization of the particles produced and evaluation of biological activities in vivo

Abstract

A apigenina (APG) é um flavonoide natural com estrutura molecular C15H10O5 (4,5,7-trihidroxiflavonona) e pode ser obtida a partir de frutas, camomila, salsa e aipo. Evidências tem sugerido que este composto possui inúmeras propriedades biológicas incluindo antioxidante, anti-inflamatória e efeitos neuroprotetores sobre o déficit cognitivo associado a perda de memória, uma condição comum associada ao envelhecimento e a demência. No entanto, a biodisponibilidade da APG é limitada pela sua baixa solubilidade, sendo considerada uma substância natural e bioativa da classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica. Essa característica leva a limitações farmacocinéticas que podem comprometer a aplicação farmacológica da APG. Neste contexto, o principal objetivo deste trabalho foi melhorar a taxa de dissolução da APG através da redução do tamanho de partícula o que, possivelmente, pode contribuir para um aumento de biodisponibilidade e efeitos biológicos. Para este fim, foi empregada a técnica Gas-Antisolvent Supercrítico (GAS), um método de formação de partículas supercríticas que pode ser utilizado para micronizar compostos com propriedades bioativas. Este processo demonstrou uma redução do tamanho médio das partículas. Especificamente, a apigenina não micronizada apresentou um tamanho médio de 26,09 µm e, após o processamento pelo método GAS, a redução do tamanho médio foi para 3,22 µm. Foram observadas reduções na cristalinidade através de XRPD após a micronização GAS, e os dados DSC corroboraram com estes resultados. A análise de FTIR comprovou a preservação do composto, indicando que não ocorreu degradação química dos compostos durante o processamento. A análise de solventes residuais indicou que a APG micronizada atende aos padrões estabelecidos pelo Conselho Internacional de Harmonização (ICH), resultando em uma concentração de solventes residuais de 127,36 ppm. Os ensaios de perfil de dissolução mostraram um aumento significativo na taxa de dissolução em soluções ácidas (pH 1,2) e tamponadas (pH 6,8). A apigenina comercial e micronizada na dose usada (30 mg/kg) não apresentou efeitos sobre o déficit de memória em peixes zebra. Contudo, no teste de locomoção a forma micronizada apresentou aumento do comportamento exploratório e das defesas antioxidantes (aumento dos níveis de NPSH). Portanto, a micronização usando a técnica GAS pode aumentar a taxa de dissolução da APG sem comprometer suas características estruturais. Os dados são sugestivos de que o efeito antioxidante parece ser melhorado na forma micronizada. Contudo, mais estudos farmacológicos e toxicológicos que incluam curva de dose para a aplicação da metodologia à indústria farmacêutica, química e alimentícia são necessários.

Abstract: Apigenin (APG) is a natural flavonoid with a molecular structure of C15H10O5 (4,5,7-trihydroxyflavonone) and can be obtained from fruits, chamomile, parsley, and celery. Evidence has suggested that this compound has numerous biological properties, including antioxidant, anti-inflammatory, and neuroprotective effects on cognitive impairment associated with memory loss, a common condition associated with aging and dementia. However, the bioavailability of APG is limited due to its low solubility and high permeability, and it is considered a natural and bioactive substance of class II of the Biopharmaceutical Classification System. This characteristic leads to pharmacokinetic limitations that may compromise the pharmacological application of APG. In this context, the main objective of this study was to improve the dissolution rate of APG through particle size reduction, which could possibly contribute to an increase in bioavailability and biological effects. To this end, the Supercritical Gas-Antisolvent (GAS) technique was employed, a supercritical particle formation method that can be used to micronize compounds with bioactive properties. This process demonstrated a reduction in average particle size. Specifically, non-micronized apigenin presented an average size of 26.09 µm, and after processing by the GAS method, the average size was reduced to 3.22 µm. Reductions in crystallinity were observed by XRPD after GAS micronization, and DSC data corroborated these results. FTIR analysis confirmed the preservation of the compound, indicating that no chemical degradation of the compounds occurred during processing. Residual solvent analysis indicated that micronized APG meets the standards established by the International Council for Harmonisation (ICH), resulting in a residual solvent concentration of 127.36 ppm. Dissolution profile assays showed a significant increase in the dissolution rate in acidic (pH 1.2) and buffered (pH 6.8) solutions. Raw and micronized apigenin at the dose used (30 mg/kg) showed no effects on memory deficit in zebrafish. However, in the locomotion test, the micronized form showed an increase in exploratory behavior and antioxidant defenses (increased NPSH levels). Therefore, micronization using the GAS technique can increase the dissolution rate of APG without compromising its structural characteristics. The data suggest that the antioxidant effect appears to be enhanced in the micronized form. However, further pharmacological and toxicological studies, including dose-response curves, are necessary for the application of this methodology in the pharmaceutical, chemical, and food industries.