Investigação do Desenvolvimento Celular de Protoplastos Isolados de Glycine max expostos ao complexo de Edição genética - CRISPR/Cas9

Abstract

As plantas possuem a parede celular, composta por matriz de celulose, hemiceluloses e pectinas que podem ser removidas através da digestão enzimática permitindo acessar os protoplastos. Eles têm sido estudados já que possuem a totipotencialidade visando edição de genomas, ou seja, a capacidade teórica da célula se multiplicar e originar um novo indivíduo geneticamente modificado. Porém, o cultivo de protoplastos in vitro possui diversas limitações, como por exemplo, meio de cultura dessas células, a contaminação e a resposta da espécie para formação de micro colônias, o que dificulta a aplicação no melhoramento genético vegetal. Para investigar essa possibilidade de melhoramento genético com a técnica de cultivo de protoplastos foi feito uma edição por CRISPR/Cas9 no locus gênico GmCPR5 (Glyma.06g145800). O DNA dos protoplastos após 16 horas de reparo foi isolado, amplificado e sequenciado. A fim de compreender a fisiologia do desenvolvimento desses protoplastos editados, os mesmos foram cultivados em meio de cultura, e fixados em placas de cultivo celular como gotas de agarose low melting (2.6%) banhadas com meio líquido. Para isso, as placas ficaram no escuro por 3 dias e depois colocadas em condições de fotoperíodo de 16h, 25 °C de temperatura. Em períodos distintos 1, 7, 14 dias o meio líquido KM8P que banhou os droplets nas placas de cultivo foi substituído pelo meio de manutenção KM8 na proporção de 2:1, 1:1 respectivamente. A capacidade de divisão celular e consecutivamente a eficiência para divisão celular foram acompanhadas por coloração do núcleo com Iodeto de propídeo e coloração com Calcofluor em microscópio óptico (Olympus BX-40 e Olympus invertido IX83 ). Os achados sugerem que a variedade comercial de soja utilizada e o meio testado proporcionaram divisão celular nos 7 primeiros dias, mas o desenvolvimento de células competentes foi prejudicado, sendo observado estruturas inviáveis ou contaminadas. Este estudo demonstrou que ainda há necessidade de investigar a competência de regeneração de protoplastos de soja quando cultivados em meio de cultura com ou sem edição genética.