Triagem molecular para o sistema Vel utilizando DNA obtido de pools de plasma de doadores de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina

Abstract

O sistema sanguíneo Vel possui relevante importância clínica e seu aloanticorpo está envolvido em reações transfusionais hemolíticas. Esse antígeno possui alta frequência populacional. O fenótipo Vel negativo é resultado da deleção homozigótica de 17 pares de base na região codificadora do gene SMIM1 (c.64_80del) e impede a expressão da proteína SMIM1. Os métodos sorológicos para determinar o fenótipo Vel negativo requerem o uso de soros raros e podem apresentar resultados falso-negativos. O objetivo desse estudo foi rastrear doadores de sangue Vel negativos do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC) e determinar a frequência do fenótipo Vel negativo, deduzido do genótipo. Neste estudo, foi aplicada uma estratégia de triagem molecular de baixo custo, por meio da metodologia PCR em tempo real e utilização do DNA extraído de pools de plasma provenientes da rotina do NAT - Teste de Ácido Nucléico - que seriam descartados. Posteriormente os homozigotos para o alelo SMIM1*64_80del foram identificados pela metodologia PCR convencional seguida de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) em paralelo com amostras de referência. A triagem molecular foi realizada em 17.472 amostras de doadores de sangue utilizando os protocolos previamente padronizados. Dessas, 309 amostras apresentaram a deleção pesquisada e foram testadas por PCR-RFLP para determinar a zigozidade e cinco foram identificadas como Vel negativas (0,03%). Considerando a tipagem sanguínea B do soro utilizado, após a realização da PCR em tempo real, 146 amostras de doadores também foram submetidas à triagem sorológica utilizando um soro com a presença de anti-Vel do inventário do hemocentro. Diferentes padrões de reatividade foram observados nos testes sorológicos variando de negativo a 2+ e com frequência de 98,63%. A frequência encontrada do alelo SMIM1*64_80del foi de 0,90%, sendo que o local de doação de Blumenau possui a maior frequência (1,14%) e Lages a maior probabilidade (7,53%) entre as regiões estudadas. Há uma relação entre a autodeclaração étnico-racial branca com a frequência da deleção. Foi realizado estudo familiar dos doadores Vel negativos e dois indivíduos foram identificados com a presença em homozigose da deleção estudada. Ambos os métodos de genotipagem, TaqMan-PCR e PCR-RFLP, representam métodos confiáveis e complementares para a detecção do alelo SMIM1 *64-80del. A triagem molecular de doadores de sangue para o tipo sanguíneo Vel é eficiente e evita as limitações da tipagem sorológica que pode apresentar resultados falso-negativos. Os dados obtidos neste estudo foram registrados no Cadastro Nacional de Sangue Raro do Ministério da Saúde e irão contribuir significativamente para o suprimento sanguíneo adequado e seguro de receptores aloimunizados com anti-Vel.

Abstract: The Vel blood system has relevant clinical importance and its alloantibody is involved in hemolytic transfusion reactions. This antigen has a high population frequency. The Vel nagative phenotype is the result of a homozygous deletion of 17 base pairs in the coding region of the SMIM1 gene (c.64_80del) and prevents the expression of the SMIM1 protein. Serological methods to determine the Vel-negative phenotype require the use of rare serum and may yield false-negative results. The objective of this study was to screen Vel-negative blood and platelet donors from the Santa Catarina Hematology and Hemotherapy Center (HEMOSC) and determine the frequency of the Vel-negative phenotype, deduced from the genotype. In this study, a low-cost molecular screening strategy was applied, using real-time PCR methodology and using DNA extracted from pools of plasma from NAT Nucleic Acid Test) routine - which would otherwise be discarded. Subsequently, homozygotes for the SMIM1*64_80del allele were identified by conventional PCR methodology followed restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in parallel with reference samples. Molecular screening was performed on 17,472 blood donor samples using previously standardized protocols. Of these, 309 samples presented the investigated deletion and were tested by PCR-RFLP to determine zygosity and five were concluded as Vel negative (0,03%). Considering the B blood type of the serum used, after performing real-time PCR, 146 donor samples were also subjected to serological screening using a serum with the presence of anti-Vel from the blood center's inventory. Different reactivity patterns were observed in serological tests ranging from negative to 2+ and with a frequency of 98,63%. The frequency found for the SMIM1*64_80del allele was 0.90%, with the Blumenau donation site having the highest frequency (1.14%) and Lages presents the highest probability (7.53%) among the regions studied. There is a relationship between white ethnic-racial self-declaration and the frequency of the deletion. A family study of Vel-negative donors was carried out and two individuals were identified with the homozygous presence of the studied deletion. Both genotyping methods, TaqMan-PCR and PCR-RFLP, represent reliable and complementary methods for the detection of the SMIM1* 64-80del allele. Molecular screening of blood donors for Vel blood type is efficient and avoids the limitations of serological typing that can present false-negative results. The data obtained in this study were registered in the National Rare Blood Registry of the Ministry of Health and will significantly contribute to the adequate and safe blood supply of recipient?s alloimmunized with anti-Vel.