Avaliação do brotamento tumoral em carcinoma epidermoide de boca e sua associação com a expressão imunoistoquímica das proteínas e-caderina e vimentina

Abstract

Introdução: O carcinoma epidermoide de boca (CEB) é a neoplasia maligna mais comum na cavidade oral. A classificação clínica através do sistema TNM tem sido universalmente aceita ao longo dos anos como fator determinante para o prognóstico e estratificação em técnicas apropriadas de tratamento. No entanto, mesmo casos de CEB categorizados em estágios iniciais pela classificação TNM podem apresentar um comportamento agressivo com um resultado fatal. Isso enfatiza a necessidade de buscarmos novos fatores prognósticos que otimizem a estratificação de risco e guiem o plano de tratamento. A avaliação histopatológica de brotamentos tumorais (BT) tem se mostrado como um biomarcador prognóstico emergente reconhecido como um fator desfavorável no prognóstico de diversos carcinomas, no entanto, seu valor em CEB ainda não é completamente compreendido. Os BT são definidos como a presença de células cancerígenas isoladas ou em grupos de até 4 células presentes na fronte de invasão. O BT representa uma alteração parcial em células epiteliais coesas para um fenótipo com motilidade, similar ao que ocorre no processo conhecido como transição epitélio-mesenquimal (TEM). A expressão diferenciada de diversas proteínas coordena a dinâmica da TEM, incluindo a diminuição da proteína e-caderina (e-CAD) e o aumento da proteína vimentina (VIM). Essa alteração nas propriedades das células malignas, de epitelial para mesenquimal, é considerada um pré-requisito para a invasão e metástase. Objetivo: determinar a significância prognóstica do BT em CEB e sua possível associação com a expressão das proteínas e-CAD e VIM. Metodologia: 47 amostras de CEB foram submetidas a marcação imunoistoquímica para pancitoqueratina, e-CAD e VIM. Todas as lâminas foram digitalizadas e analisadas com o software QuPath. Os casos foram submetidos à classificação histológica em relação à diferenciação neoplásica e à intensidade de BT, com auxílio da imunomarcação com anti-pancitoqueratina. O BT foi avaliado quantitativa e qualitativamente, classificadas em alta intensidade (>4 células) ou baixa/ausente (=4 células). A mensuração do BT foi realizada em uma área correspondente ao aumento de 200x na fronte de invasão e áreas de ?hot spot?, em ressecções e biópsias incisionais respectivamente. Para avaliação das proteínas da TEM a mesma área de ?hot spot? foi identificada para a e-CAD e VIM. A avaliação foi quantitativa (% de células positivas em relação ao número total de células) e qualitativa (classificada em fraca, moderada e forte). A análise estatística não paramétrica, realizada separadamente para o grupo das ressecções e das biópsias incisionais, investigou associações do BT e proteínas da TEM com as características clínicas e patológicas. A sobrevida foi avaliada pelo método de Kaplan Meier e a comparação entre as curvas pelo teste de log rank. A significância estatística estabelecida foi de 5%. Resultados: No grupo das ressecções (N=27) o alto número de BT, na análise quantitativa e qualitativa, apresentou associação com uma menor diferenciação histopatológica das amostras (p=0,033 e p=0,05, respectivamente). A alta intensidade de BT também foi associada a uma maior expressão da proteína VIM (p=0,029) e menor expressão da e-CAD (p=0,030). A expressão de e-CAD nas ressecções foi associada a um menor tempo livre de recorrência (p=0,046). O grupo das biópsias incisionais evidenciou uma correlação positiva moderada entre a expressão de VIM e a uma menor diferenciação histopatológica (rho de Spearman= 0,628; p=0,003). Um maior número de células positivas para e-CAD foi associada a presença de metástase em linfonodos regionais (p=0,031). Conclusão: O BT está associado a alterações semelhantes a TEM, e evidências de TEM parcial foram encontradas em nosso estudo. Nossos dados fornecem indícios para o significado biológico e clínico da expressão de VIM e e-CAD como potenciais biomarcadores preditivos para identificar pacientes com metástase linfonodal ou prognóstico ruim no CEB.

Abstract: Background: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignancy of the oral cavity. The clinical TNM classification has been the universally accepted determinant for prognosis and stratification into appropriate treatment strategies. However, even OSCC classified as early-stage tumours by the TNM classification may behave aggressively with a fatal outcome. This emphasizes the demand for novel prognostic factors to optimize risk stratification and guide treatment decisions. Despite the extensive association of tumor budding (TB) with tumor progression and unfavorable prognosis for diverse types of cancer, there are only limited reports on the role of TB in OSCC. TB is the presence of single carcinoma cells or small clusters (up to 4 cells) located at the invasive front of malignant epithelial tumors. TB represents a partial switch in epithelial cells from a cohesive to a mobile phenotype, similar to what happens in a process known as epithelial-mesenchymal transition (EMT). Differential expression of several proteins dictates the dynamics of EMT, including downregulation of E-cadherin (E-CAD) and upregulation of vimentin (VIM). This change in carcinoma cells properties from epithelial to mesenchymal, is considered a prerequisite for invasion and metastasis. Aim: Investigate the prognostic value of TB in OSCC, as well as determine its association with E-CAD and VIM expression. Methodology: We examined the expression of cytokeratin, E-CAD, and VIM in 47 OSCC samples. Glass slides were scanned, and the images were imported to the open-source software QuPath. TB was examined by quantitative and qualitative methods, using a two-tier system with a cut-off point of 4 tumor buds to classify in high (>4 cells) or low intensity (=4 cells). The cases were submitted to histological classification concerning neoplastic differentiation and BT intensity, with the aid of immunostaining with anti-pan-cytokeratin. The field area where the counting was performed corresponds to a 200x magnification at the tumor invasion front and hot spot areas for resection and biopsies, respectively. Immunoreactivity was performed at the same hotspot areas for each marker. Evaluation based on staining intensity was examined by quantitative (% of positive cells) and qualitative (weak, moderate, and strong) methods. Nonparametric statistics were performed, separately in resection and biopsy samples, to evaluate the correlation between TB, e-CAD, and VIM with clinicopathological parameters. The survival rate was estimated using the Kaplan?Meier method and compared by the log-rank test. A P-value <0.05 was considered statistically significant. Results: The resection group (N=27) showed that high-grade TB was correlated with the worst pattern of histopathological differentiation in quantitative and qualitative analysis (p=0,033 and p=0,05, respectively). High-grade TB is associated with strong VIM expression (p=0,029) and adversely low presence of e-CAD expression (p=0,030). The analysis for disease-free survival also showed that e-CAD expression was correlated with poorer survival (p=0,046) in the resection group. The incisional biopsy group showed a positive correlation between VIM expression and poor differentiation (Spearman?s rho= 0,628; p=0,003). A higher number of e-CAD positive cells was also correlated with regional lymph node metastasis (p=0,031). Conclusion: Tumor budding was associated with EMT-like changes, and at least partial EMT was found in our series. Our data provide evidence for the biological and clinical significance of e-CAD and VIM expression as potential predictive biomarkers for identifying patients with lymph node metastasis or poor prognosis in OSCC.