Avaliação de um imunoensaio ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) padronizado utilizando proteína recombinante de nucleocapsídeo(50-350) de SARS-CoV-2 como ferramenta de avaliação de resposta imune humoral em indivíduos vacinados com CoronaVac.

Abstract

Introdução: A Covid-19 é a doença causada pelo vírus SARS-CoV-2 que foi identificado no início do ano de 2020 como o responsável por um quadro de infecção respiratória grave que primeiramente atingiu pessoas da cidade de Wuhan na China, mas que acabou se disseminando pelo restante do planeta, levando a um estado de pandemia. Dentre as proteínas estruturais do SARS-CoV-2, a proteína de nucleocapsídeo (N) que está associada ao RNA do vírus destaca-se por possuir uma alta conservação entre os diferentes vírus da família Coronoviridae, além de ser capaz de gerar uma resposta imune humoral, havendo a possibilidade de uso desta proteína como alvo para produção de testes de vigilância epidemiológica. Nesta mesma linha, o imunoensaio ELISA se mostra uma importante ferramenta de avaliação epidemiológica, principalmente por ser prático, possuir baixo custo e não necessitar de uma grande infraestrutura ou investimento para ser realizado. Neste trabalho, utilizamos um ELISA indireto para avaliar a presença de IgG anti proteína N padronizado utilizando um fragmento (50-350 aa) da proteína de nucleocapsídeo em uma coorte de voluntários vacinados com CoronaVac. Metodologia: A proteína N(50-350) foi expressa utilizando a bactéria Escherichia coli BL21-Codon Plus, sendo purificada por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). A coorte foi recrutada durante o mês de março de 2020 dentro do Laboratório de Imunobiologia (LIM) da Universidade Federal de Santa Catarina. As amostras de soro foram analisadas utilizando o ELISA indireto utilizando como antígeno o fragmento (50-350 aa) da proteína N do SARS-CoV-2. Resultados: O fragmento de proteína N(50-350) é expresso pela E. Coli BL21-Codon Plus, sendo purificado por uma coluna de afinidade de íons metálicos. O ELISA indireto anti N(50-350) foi otimizado, sendo sensibilizado com 3μg/ml de proteína para sensibilizar a placa, solução de PBS + 5% de leite em pó para o bloqueio durante 2 horas, incubação com o soro diluído 1/100 em solução de bloqueio PBS + 5% de leite em pó + 0,05% de Tween20 por 16 horas seguida por incubação durante 1 hora e 30 min com anticorpo secundário IgG Goat anti-Human HRP com a diluição 1/5000 na solução de bloqueio, iniciando a reação enzimática com tetrametilbenzidina (TMB) e parando a reação com HCl 1N após 7 min. Foram recrutadas 23 pessoas para a coorte estudada, sendo 14 mulheres e 9 homens. O ELISA após a otimização apresentou uma sensibilidade de 95% para a coorte estudada para a detecção de IgG anti-proteína N do SARS-CoV-2. Conclusão: A vacina CoronaVac ao ser aplicada gera uma resposta imune humoral moderada para a proteína N do SARS-CoV-2. O ELISA indireto contendo o fragmento de proteína N(50-350) é capaz de diferenciar amostras de pessoas que nunca tiveram o contato com o vírus (pré-pandêmicas) de pessoas vacinadas com CoronaVac ao se avaliar a presença de IgG. Além disso, este imunoensaio foi capaz de diferenciar as amostras de soro de pessoas vacinadas com CoronaVac que tiveram contato anterior à vacinação com o vírus SARS-CoV-2 de pessoas vacinadas com CoronaVac que não tiveram contato com este vírus.