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A COVID-19 é uma doença causada por um novo coronavírus designado como síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). Como outros coronavírus (ordem Nidovirales, família Coronaviridae, subfamília Coronavirinae), o SARS-CoV-2 é um vírus envelopado com um genoma de RNA de fita simples de sentido positivo. O vírus SARS-CoV-2 espalha-se pelas vias do trato respiratório, por gotículas, secreções respiratórias e/ou por contato direto. Os sintomas clínicos mais comuns são febre, tosse, dificuldade respiratória e dor de cabeça, iniciando primeiramente no trato respiratório superior, podendo, com a evolução decair para o trato respiratório inferior, levando a pneumonia, insuficiência respiratória aguda grave e ao óbito. O vírus possui quatro proteínas estruturais necessárias para regular a função e a estrutura viral: proteína do nucleocapsídeo (N), da membrana (M), do envelope (E) e a proteína spike (S). O gene que codifica a proteína S foi o alvo do presente trabalho, pois permite a ligação do vírus aos receptores da superfície da célula hospedeira e subsequente fusão entre as membranas facilitando a entrada do vírus na célula. O pequeno RNA de interferência (siRNA) é uma ferramenta prospectiva da via de interferência do gênica que pode controlar as infecções virais humanas pela supressão da expressão de um gene viral por meio da inviabilização do RNA mensageiro (mRNA) pela ligação por complementaridade. No entanto, para que esse mecanismo ocorra, são necessários nanocarreadores para a proteção e transporte dos ácidos nucleicos para o interior da célula. Sendo assim, o objetivo do presente estudo é desenvolver uma nova abordagem terapêutica utilizando siRNA para o gene codificador da proteína estrutural S do vírus SARS-CoV-2 visando diminuir a replicação do vírus em uma linhagem de fibroblasto pulmonar. Para isso, sistemas nanoestruturados constituídos por fosfato de cálcio e copolímero de polietileno(glicol)-poliânion foram preparados através da auto associação dos componentes. As nanopartículas foram avaliadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e índice de polidispersão (PdI) no equipamento Zetasizer Nano ZS. As formulações apresentaram uma distribuição de tamanho estreita com diâmetro médio em 72 ± 0,5 nm e PdI de 0,13 ± 0,02. Para o desenho do siRNA para o gene que codifica a proteína S, foi utilizada a ferramenta Whitehead siRNA Selection Server. Utilizou-se como critério de inclusão sequências obtidas que apresentassem o mínimo de homologias com outros genes humanos, evitando-se assim pareamentos inespecíficos. Para avaliação da homologia das sequências foi utilizada a ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ) de nucleotídeos (National Center for Biotechnology Information - NCBI). Ainda, a sequência complementar ao mRNA foi escolhida de acordo com os critérios propostos por Fakhr et al. (2016)*. Assim, a sequência que melhor se enquadrou nos critérios propostos para desenho de siRNAs foi UUAAAAUAUAAUGAAAAUGGA, ao qual foi sintetizada e adquirida comercialmente. O presente estudo tem como perspectivas a avaliação da citotoxicidade das nanopartículas contendo o siRNA (NP-siRNA) em linhagem celular de fibroblasto pulmonar que será avaliada pela resposta metabólica celular. Além disso, a avaliação da carga viral em células pulmonares infectadas pelo SARS-CoV-2 após tratamento com NP- siRNA será avaliada pela quantificação do número de cópias de RNA viral utilizando a técnica de RT-qPCR. Por fim, a utilização de siRNA para proteína estrutural S do vírus pode levar a resultados interessantes, com diminuição significativa da replicação viral, que posteriormente podem ser testados em estudos futuros in vivo. |
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