Proteína CHAP1 de Trypanosoma cruzi: Ferramentas para caracterização funcional

Abstract

O Trypanosoma cruzi é o protozoário agente etiológico da doença de Chagas. Esse parasito possui um ciclo de vida heteroxênico, compreendendo um hospedeiro mamífero e um invertebrado. Para estabelecer a infecção e manter o seu metabolismo, o T. cruzi precisa estabilizar os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN) provenientes do sistema imune de seus hospedeiros, bem como produzidos de forma intrínseca. Para não sofrer com esse estresse oxidativo e nitrosativo, o T. cruzi possui um sistema antioxidante exclusivo baseado na tripanotiona, um tiol formado por duas glutationas e uma espermidina, que é sintetizado por uma reação de duas etapas, ambas catalisadas pela enzima tripanotiona sintetase (TryS). Essa enzima é essencial para o metabolismo do parasito. Em estudos genômicos do nosso grupo de pesquisa, foi verificada a presença de outras duas sequências anotadas nos bancos de dados de tripanosomatídeos como TryS, porém elas não possuem o domínio de síntese, apenas o domínio CHAP e por essa razão essas sequências foram renomeadas como TcChap1 e TcChap2. A TcChap1 difere da TryS por ser menor e possuir endereçamento para mitocôndria. Assim, não se tem claro qual a função desta proteína e, portanto, o objetivo deste trabalho é construir ferramentas para a caracterização funcional da proteína CHAP1 de Trypanosoma cruzi. Inicialmente, foi realizada a expressão heteróloga da proteína CHAP1 visando a posterior produção de um anticorpo policlonal. A proteína foi expressa e purificada da fração insolúvel do extrato proteico bacteriano, no entanto, apesar dos diversos testes de expressão para a obtenção da proteína na forma nativa não se obteve expressão em quantidade suficiente para a purificação. Apesar da imunização de camundongos ter sido realizada o soro obtido não foi capaz de reconhecer a proteína nos ensaios realizados. Em paralelo foi construído um plasmídeo com o intuito de fazer a superexpressão da TcCHAP1 no parasito. Este plasmídeo foi usado na transfecção de T. cruzi e após seleção de uma população homogênea, os parasitos mutantes foram desafiados com peróxido de hidrogênio. Os parasitos superexpressando TcCHAP1 não apresentaram diferenças morfológicas nem alteração na capacidade de sobreviver ao estresse oxidativo promovido pela exposição ao peróxido quando comparados com os parasitos selvagens. Desta forma, a proteína TcCHAP1 não parece estar envolvida no metabolismo redox extrínseco. Também foi realizada uma tentativa de deleção do gene que codifica para TcCHAP1. A estratégia incluiu o desenho dos iniciadores necessários para a construção dos sgRNAs e os templates de reparo para TcCHAP1, assim como a transfecção do mix de deleção. Os parasitos passaram por processo de seleção por antibióticos, porém não foi possível observar a deleção do gene.