Análise in vitro da capacidade de diferenciação osteogênica de sinvastana incorporada em PLGA sobre superfície de titânio

Abstract

Apesar das altas taxas de sucesso das reabilitações orais utilizando implantes dentários, ainda podem ser observados casos perda óssea peri-implantar ao longo do tempo. A fim de garantir maior estabilidade marginal, tem se estudado biomateriais com a incorporação de fármacos que possam ser liberados localmente e auxiliar no processo de manutenção peri-implantar. O objetivo desse estudo é avaliar a ação de 0,6% sinvastatina (SIN) incorporada ao ácido polilático co-glicólico (PLGA) sobre a superfície do titânio (Ti) na diferenciação osteogênica de células-tronco de polpa de dente decíduo (SHEDs), com o intuito de propor um revestimento para biofuncionalizar componentes protéticos. Discos de Ti grau 4 (8 x 3 mm) foram distribuídos nos grupos: G0) Ti (n = 24); G1) Ti+PLGA (n = 24); G2) Ti+PLGA+SIN0,6% (n = 24). G1 e G2 receberam tratamento por imersão em solução de PLGA ou PLGA+SIN0,6%, respectivamente, e, em seguida, foi aguardada a total evaporação do solvente. A liberação da SIN (G2) foi avaliada em triplicata por imersão em PBS por até 28 dias. Após o preparo das amostras, as SHEDs foram semeadas sobre os discos em dispostos em placas de cultura com meio não osteogênico. Além dos grupos experimentais, foram testados três grupos de controle celular: G3) SHEDs em meio não osteogênico; G4) SHEDs em meio osteogênico; e G5) osteoblastos MC3T3- E1 em meio osteogênico. Foram aplicados os ensaio de MTS para verificar a citotoxicidade das amostras e de Pico Green para determinar a proliferação celular. Empregou-se linhagens de fibroblastos e SHEDs humanas. A capacidade de diferenciação osteogênica foi investigada pela quantificação da atividade da fosfatase alcalina (ALP), bem como das proteínas ósseas osteocalcina (OCN) e osteonectina (ONT) e do cálcio (Ca). Por fim, a mineralização da matriz extracelular foi investigada pela coloração histológica de von Kossa. Os resultados foram analisados estatisticamente por análise unidirecional de variância (one-way ANOVA) seguida do teste de Tukey (p <0,05). Observou-se que G0, G1 e G2 apresentaram viabilidade celular superior a 70% para ambas as linhagens celulares, em todos os períodos avaliados. A liberação de SIN foi de aproximadamente 13% em 28 dias. G2 promoveu maior atividade de ALP em 3 dias, maior expressão de OCN em 14 e 21 dias, maior expressão de ONT em 14 dias, as maiores quantificações de Ca em 14 e 21 dias, bem como a maior mineralização da MEC observada pela coloração de von kossa em 28 dias. G1 promoveu maior expressão de ONC em 21 dias. Os grupos teste (G1 e G2) apresentaram melhores resultados de diferenciação osteogênica comparado com os grupos controles (G3, G4 e G5), exceto para a coloração de von kossa, onde G4 obteve os maiores resultados. G4 e G5 apresentaram as menores atividades de ALP em 7 e 10 dias. G5 promoveu a menor atividade de ALP em 3 dias. G3, G4 e G5 apresentaram as menores expressões de OCN em 14 e 21 dias. As menores expressões de ONC foram apresentadas por G3, seguido de G4 e de G5 em 14 e 21 dias. Pode-se concluir que a biofuncionalização da superfície de Ti revestido com PLGA incorporando SIN foi capaz de promover um sistema biocompatível, capaz de promover uma liberação gradativa de SIN e de estimular a diferenciação osteogênica das células-tronco mesenquimais.

Abstract: Cases of bone loss around dental implants can still be observed even with high success rates of current systems. For this reason, biomaterials have been improved by drug incorporation that can be released locally and ensure a greater marginal tissue stability. This study aimed to evaluate the effect of 0.6% simvastatin (SIM) incorporated into polyglycolic acid (PLGA) on titanium (Ti) surface in the osteogenic differentiation of deciduous tooth pulp stem cells (SHEDs), proposing a coating to biofunctionalize prosthetic components. Grade 4 Ti disks (8 x 3 mm) were distributed in the following groups: G0) pure Ti; G1) Ti + PLGA; G2) Ti + PLGA + SIM0.6%. G1 and G2 were treated by immersion in PLGA or PLGA + SIM0.6% solution, respectively, and then was await 24h for complete solvent evaporation. SIM release (G2) was assessed in triplicate by immersion in phosphate saline buffer solution (PBS) for up to 28 days. In culture plates, SHEDs were seeded on samples with non- osteogenic medium and, in addition, three cell control groups were tested: G3) SHEDs in non- osteogenic medium; G4) SHEDs in osteogenic medium; and G5) MC3T3-E1 osteoblasts in osteogenic medium. Cell proliferation and cytotoxicity assays were performed. The osteogenic differentiation was investigated by quantification of alkaline phosphatase (ALP) activity, as well as calcium (Ca) and the bone proteins osteocalcin (OCN) and osteonectin (ONT). Mineralization of extracellular matrix (ECM) was investigated by von Kossa histological staining. The results were statistically analyzed by univariate analysis of variance (one-way ANOVA) followed by Tukey's test (p <0.05). SIM release was approximately 13% in 28 days. G0, G1 and G2 presented cell viability greater than 70% for both cell lines, in all times evaluated. G2 promoted higher ALP activity in 3 days, higher OCN expression in 14 and 21 days, higher ONT expression in 14 days, higher Ca quantification in 14 days, as well as higher ECM mineralization observed by von Kossa staining in 28 days. G1 promoted higher expression of ONC in 21 days. The test groups (G1 and G2) presented better osteogenic differentiation results compared to control groups (G3, G4 and G5), except for von kossa staining, where G4 obtained the highest results. G4 and G5 had the lowest ALP activity in 7 and 10 days. G5 had the lowest ALP activity in 3 days. G3, G4 and G5 presented the lowest OCN expression at 14 and 21 days. The lowest ONT expressions were presented by G3 followed by G4 and G5 at 14 and 21 days. It can be concluded that biofunctionalisation of Ti surface coated by PLGA incorporating SIM constituted a biocompatible system that can promote a gradual release of SIM and stimulate osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.