Participação do citoesqueleto e os efeitos de diferentes salinidades e temperaturas na germinação da macroalga Gelidium floridanum

Abstract

A liberação, adesão e germinação de esporos são eventos indispensáveis para o sucesso do desenvolvimento da macroalga de grande importância econômica Gelidium floridanum. Assim o trabalho teve como objetivos principais: 1) verificar a presença e participação da actina, miosina e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) na polarização e formação do tubo germinativo de tetrásporos; 2) avaliar a tolerância mínima e máxima frente as diferentes salinidades e temperaturas e, por conseguinte, investigar os efeitos morfofisiológicos provocados no desenvolvimento inicial de tetrásporos. Para o primeiro objetivo, após a liberação, os tetrásporos foram cultivados por um período de seis horas com os inibidores citocalasina B (inibidor de F-actina), latrunculina B (inibidor de G-actina), LY294002 (inibidor de PI3K) e BDM (inibidor de miosina). As contagens de germinação e morfologia foram verificadas através da microscopia de luz e presença de filamentos de actina, celulose e organização dos cloroplastos através da microscopia confocal de varredura a laser. Para o segundo objetivo, foram cultivados tetrásporos nas salinidades 24, 28, 32 (controle), 36 e 40 ups por um período de 6 e 24 horas e em diferentes temperaturas, 15, 18, 21, 24 (controle), 27 e 30 ºC, por 24 horas. Análises da liberação, adesão e taxa de germinação foram realizadas, como também análises da viabilidade celular (MTT), quantificação dos pigmentos fotossintetizantes, quantificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e análises da organização subcelular. Nas amostras controle de cada experimento (32 ups e 24 ºC) ocorreu a formação do tubo germinativo, da parede celular e deslocamento de organelas, divisão celular e formação de rizoides. Na presença de inibidores citocalasina B, latrunculina B e BDM os tetrásporos não apresentaram formação de tubo germinativo e de parede celular. Os tetrásporos também não apresentaram a organização de F-actina, e os cloroplastos, com formato esférico, permaneceram na região central do esporo. O inibidor LY294002, inibiu a formação do tubo nas concentrações mais elevadas. Em relação as condições abióticas, as melhores condições de desenvolvimento de tetrásporos foram em salinidade de 28 a 36 ups e da temperatura de 21 a 27 ºC. Nas condições hiposalinas (24 ups) ocorreu uma inibição no desenvolvimento de tetrásporos e em condição hipersalina (40 ups) ocorreu um retardo no seu desenvolvimento, com diferenças nas concentrações de pigmentos fotossintetizantes tanto em 6 como 24 horas. Nas condições de baixas temperaturas (15 e 18 ºC) ocorreu uma inibição no desenvolvimento de tetrásporos e em temperaturas elevadas (30 ºC) ocorreu o maior índice de mortalidade. A maior quantidade de ERO ocorreu nas temperaturas 15 e 30 ºC, influenciando na taxa de germinação. Com estes resultados concluímos que os F-actina regulam os processos de polarização e germinação, e que a polarização assimétrica dos F-actina é regulada através da PI3K, no desenvolvimento inicial de tetrásporos. A espécie apresentou um pequeno limite de tolerância à salinidade, entre 28 a 36 ups, e de 21 a 27 ºC na temperatura. Entretanto, estas pequenas variações de salinidade e temperatura foram suficientes para alterar o padrão de desenvolvimento de tetrásporos de G. floridanum.

Abstract : The release, adhesion and germination of spores are indispensable events for the successful development of the macroalga of great economic importance Gelidium floridanum. The main objectives of this study were: 1) to verify the presence and participation of actin, myosin and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in the polarization and formation of the tetraspores germ tube; 2) to verify the minimum and maximum tolerance against different salinities and temperatures, and therefore to investigate the possible morphophysiological effects caused in the initial development of tetraspores. For the first objective, after release, tetraspores were cultured for a period of 6 hours with the inhibitors cytochalasin B (inhibitor of F-actin), latrunculin B (G-actin inhibitor), LY294002 (PI3K inhibitor) and BDM (myosin inhibitor), and the germination and morphology rates were verified through light microscopy and the presence of actin filaments, cellulose and chloroplast organization through confocal laser scanning microscopy. For the second objective, tetraspores were grown in the salinities 24, 28, 32 (control), 36 and 40 ups for a period of 6 and 24 hours and at different temperatures, 15, 18, 21, 24 (control), 27 and 30 ºC, for 24 hours. (MTT), quantification of photosynthetic pigments, quantification of reactive oxygen species (ROS), and ultrastructural analysis. In the control samples of each experiment (32 ups and 24 ºC) the formation of germ tube, cell wall and organelle displacement, presence of Golgi bodies and florid starch grains, cell division and formation of rhizoids occurred. In the presence of cytochalasin B, latrunculin B and BDM inhibitors the tetraspores did not present germ tube and cell wall formation, the organization of the F-actin and the spherical-shaped chloroplasts remained in the central region. The inhibitor LY294002 did not allow the formation of the tube at the higher concentrations. In the abiotic conditions, the best conditions for the development of tetraspores were salinity of 28 to 36 ups and temperature of 21 to 27 ºC. Under hypersaline conditions (24 ups), inhibition occurred in the development of tetraspores and in the hypersaline condition (40 ups) there was a delay in its development, with differences in the concentrations of photosynthetic pigments in 6 and 24 hours. Under low temperature conditions (15 and 18 °C) inhibition occurred in the development of tetraspores and at high temperatures (30 °C) the highest mortality rate occurred. The highest amount of ROS occurred at temperatures 15 and 30 °C, influencing the germination rate. With these results we conclude that F-actin regulates the processes of polarization and germination, and that asymmetric polarization of F-actin is also performed through PI3K in the initial development of tetraspores. The species presented a small limit of tolerance to the salinity, between 28 to 36 ups, and of 21 to 27 ºC in the temperature. These small variations in salinity and temperature were enough to alter the development pattern of tetraspores of G. floridanum.