Aspectos comportamentais e morfofuncionais do estriado e hipocampo no modelo animal YAC128 da doença de Huntington: investigação do efeito neuroprotetor do probucol

Abstract

A doença de Huntington (DH) é uma desordem neurodegenerativa monogênica, causada por um aumento da repetição do trinucleotídeo glutamina no gene Huntingtina (HTT), codificando uma proteína mutada com trato expandido de poliglutamina. A doença tem caráter progressivo, é invariavelmente fatal 15-20 anos após o início dos primeiros sintomas motores. É caracterizada por uma tríade de sintomas: motor, cognitivo e psiquiátrico. Os sintomas psiquiátricos e cognitivos, muitas vezes, preedem os sintomas motores. Os sintomas iniciam-se na fase adulta com déficits motores e cognitivos sutis e distúrbios psiquiátricos como a depressão. A principal característica neuropatológica é a degeneração seletiva do estriado. No entanto, o envolvimento de outras estruturas não estriatais como o hipocampo podem contribuir para as alterações não motoras da DH. Os camundongos transgênicos YAC128 constituem um importante modelo para o estudo da DH e reproduzem as alterações comportamentais presentes em indivíduos portadores da doença. Baseado nesse complexo quadro sintomático da doença e no fato dos mecanismos que levam a neurodegeneração na DH ainda não estarem elucidados, no primeiro capítulo dessa tese uma caracterização longitudinal de alterações comportamentais, da respiração mitocondrial (hipocampo e estriado), bem como a avaliação das possíveis alterações morfológicas e ultraestruturais hipocampais presentes no modelo animal YAC128 para DH foi realizada. Os animais apresentaram comportamento tipo-depressivo e déficit motor em ambas as fases sintomáticas avaliadas, inicial (4 meses) e tardia (12 meses), demonstrado pelo Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) e rotarod, respectivamente. O comportamento anedônico, que é considerado um dos sintomas do transtorno depressivo, também esteve presente no modelo YAC128 aos 12 meses de idade, avaliado pelo Teste da Borrifada de Sacarose (TBS). Os déficits cognitivos foram avaliados apenas na fase sintomática tardia utilizando o rotarod e teste de natação no labirinto em T (T-maze). Os camundongos YAC128 demonstraram déficit na aquisição de habilidades motoras caracterizado pela latência reduzida para queda e aumento do número de quedas no rotarod quando comparado aos animais selvagens. Adicionalmente, no T-maze, os animais YAC128 demonstraram um déficit na estratégia de resposta, caracterizado pelo maior número de erros na escolha dos braços corretos no labirinto. Esses déficits na estratégia somados aos prejuízos na aquisição da aprendizagem motora caracterizam o déficit cognitivo na fase sintomática tardia no modelo YAC128. Adicionalmente, no teste do campo aberto (TCA), foi demonstrada a presença do comportamento tipo-ansioso na fase sintomática inicial e hipolocomoção na fase sintomática tardia no modelo YAC128. A avaliação da respiração mitocondrial em homogenatos de estriado e hipocampo na fase sintomática inicial (3-4 meses) e tardia (11-14 meses) não revelou alterações nos principais parâmetros da função mitocondrial, com exceção da respiração de rotina, que foi reduzida nos animais YAC128 na fase sintomática tardia quando comparados aos animais selvagens. Corroborando com esses resultados, os animais YAC128 não apresentaram alterações robustas na morfologia ultraestrutural mitocondrial. Apenas algumas mitocôndrias foram vistas com leve perda das cristas. Em contraste, o Reticulo Endoplasmático Rugoso (RE) e aparelho de Golgi apresentaram intensa dilatação. A análise de cortes semifinos revelou redução do número de células granulares no GD e presença de neurônios degenerados, hipercrômicos, com morfologia irregular e condensação citoplasmática e nuclear no estriado e giro denteado (GD) hipocampal de animais YAC128. Células granulares com morfologia irregular caracterizada por retração citoplasmática e nuclear e aumento da densidade citoplasmática foram visualizadas nos camundongos YAC128, caracterizando um processo degenerativo no GD hipocampal desses animais, mas o exato tipo de morte celular ainda não está completamente definido. Como até o presente momento não há cura para a DH, o segundo objetivo deste trabalho foi investigar o efeito neuroprotetor do probucol como estratégia farmacológica para modular as alterações comportamentais e morfológicas presentes no modelo YAC128. O tratamento com probucol (30mg/kg/dia, na água de beber), um composto hipocolesterolemiante com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, foi iniciado aos 30 dias de idade. Essa idade é caracterizada como uma fase assintomática nos camundongos YAC128 e se estendeu por 5 meses até os animais completarem 6 meses de idade. A avaliação comportamental foi realizada aos 2, 4 e 6 meses de idade. O probucol foi capaz de reverter o comportamento tipo-depressivo em camundongos YAC128 aos 4 e 6 meses de idade. Aos 2 meses de idade, os camundongos YAC128 apresentaram comportamento tipo-ansioso, caracterizado pela redução do tempo gasto no centro do TCA, o tratamento com probucol não alterou esse comportamento. A avaliação morfológica revelou uma redução do volume do estriado, do hipocampo total e do GD hipocampal em camundongos YAC128 aos 6 meses de idade. Nesta mesma idade, a coloração Fluoro-Jade B mostrou um aumento do processo degenerativo no estriado. Além disso, uma diminuição da diferenciação neuronal (utilizando o marcador endógeno doublecortina, DCX) foi demonstrada no GD hipocampal de animais YAC128. O probucol não alterou esses parâmetros morfológicos e degenerativos. Anormalidades na cadeia respiratória mitocondrial, bem como alterações morfológicas mitocondriais, não estão presentes em fases sintomáticas no modelo YAC128. Possivelmente, as alterações comportamentais presentes em fases iniciais e tardias da DH não estão relacionadas com alterações na função mitocondrial. Porém, evidenciamos o processo degenerativo neuronal no estriado e no GD hipocampal somados a alterações ultraestruturais presentes nas células granulares do GD, como robusta dilatação do RE e do aparelho de Golgi. O tratamento crônico com probucol foi capaz de prevenir o comportamento tipo-depressivo em camundongos YAC128 nos estágios iniciais da doença. Estes efeitos foram independentes de sua ação na plasticidade estrutural hipocampal. Nossos resultados reforçam o caráter progressivo da DH e confirmam o uso dos camundongos YAC128 como uma ótima ferramenta para estudar a progressão da doença e testar estratégias terapêuticas.<br>

Abstract : Huntington's disease (HD) is a monogenic neurodegenerative disorder, caused by a CAG triplet repeats expansion in the Huntingtin gene (HTT), which encodes an expanded polyglutamine stretch in the N-terminal of the mutated protein. The disease has a progressive character and is invariably fatal 15-20 years after the onset of the first motor symptoms. It is characterized by a triad of symptoms: motor, cognitive and psychiatric. Psychiatric and cognitive symptoms often precede the onset of motor symptoms and the definitive diagnosis is concluded based on genetic testing and family history of HD. Symptoms begin in adulthood with motor deficits and subtle cognitive and psychiatric disorders such as depression. In more advanced phases, there is a loss of control of voluntary movements, rigidity, and dementia, resulting in a picture of intense functional impairment. The main neuropathology is selective degeneration of the striatum. However, the involvement of other non-striatal structures such as the hippocampus may contribute to non-motor symptoms. The transgenic YAC128 mice constitute an important model for the study of HD and reproduce the behavioral changes present in individuals with the disease. Since the mechanisms that lead to HD neurodegeneration have not yet been fully elucidated, the first chapter of this thesis presents a longitudinal characterization of behavioral alterations, mitochondrial function (in the hippocampus and striatum), and hippocampal morphological and ultrastructural alterations in the YAC128 HD transgenic mouse model. Animals presented a depressive-like behavior and motor deficits in both the initial symptomatic (4 months) and late (12 months) phases, demonstrated by the Tail Suspension Test (TST) and rotarod, respectively. Anhedonic behavior, a hallmark of depressive disorder evaluated with the Splash Test, was also present in YAC128 mice at 12 months of age. Cognitive deficits were assessed only in the late symptomatic phase using rotarod and the T-maze swimming test. YAC128 mice demonstrated locomotor impairments characterized by reduced latency to fall and increased number of rotarod falls when compared to wild-type littermates, and these motor deficits persisted into the later stages of disease progression. Additionally, in the T-maze aquatic test, YAC128 animals demonstrated a deficit in strategy response, characterized by numerous errors in choosing the correct maze arm. This strategy deficit together with decreased acquisition of motor learning indicates the presence of cognitive deficits in the late symptomatic stage in this HD transgenic mouse model. In addition, in the open field test (OFT), the presence of anxiety-like behavior in the initial symptomatic phase and hypolocomotion in the late symptomatic phase in the YAC128 model was demonstrated. Evaluation of mitochondrial respiration in striatal and hippocampal homogenates in the initial (3-4 months) and late (11-14 months) symptomatic phases revealed no alterations in the main parameters of mitochondrial function, with the exception of basal respiration, which was reduced in YAC128 animals in the late symptomatic phase when compared to wild-type animals. In agreement with these results, the YAC128 animals did not present robust alterations in mitochondrial ultrastructural morphology. Only a few mitochondria were seen with slight loss of crests. In contrast, changes in the Endoplasmic Reticulum (ER) and Golgi apparatus appeared dilatated. The analysis of semithin sections revealed revealed a reduction in the number of granular cells in DG and the presence of degenerate, hyperchromic neurons with irregular morphology and cytoplasmic and nuclear condensation both in the striatum and the hippocampal dentate gyrus (DG) of YAC128 animals. The ultrastructural analysis of the YAC128 hippocampus by Transmission Electron Microscopy, a cell type with irregular morphology characterized by cytoplasmic and nuclear retraction and increased cytoplasmic density was visualized. These results demonstrate a degenerative process in the hippocampal DG of YAC128 animals, but the exact type of cell death is not yet fully elucidated. Since there is currently no cure for HD, the second objective of this study was to investigate the effect of probucol as a pharmacological strategy to modulate the behavioral and morphological changes present in the YAC128 HD transgenic mouse model. Treatment with probucol (30mg / kg/day in drinking water), a lipid-lowering compound with antioxidant and anti-inflammatory properties, was started at 30 days of age, when the animals are still asymptomatic. YAC128 mice were treated for 5 months until they reached 6 months of age. Behavioral assessment was performed at 2, 4 and 6 months of age. Probucol was able to reverse the depressive-like behavior in YAC128 mice at both 4 and 6 months of age. At 2 months of age, the YAC128 mice also presented anxiety-like behaviors, characterized by a reduction in the time spent in the center of the OFT, but treatment with probucol did not alter this behavior. Morphological evaluation revealed a reduction in the volume of the striatum, total hippocampus and hippocampal DG region in YAC128 mice at 6 months of age. At this same age, Fluoro-Jade B staining showed an increase in the degenerative process in the striatum. In addition, a decrease in neuronal differentiation (using the immature neuronal marker doublecortin, DCX) was demonstrated in the hippocampal DG of YAC128 mice. Probucol did not alter these morphological and degenerative parameters. In conclusion, this Thesis shows that abnormalities in mitochondrial respiratory chain, as well as mitochondrial morphological changes, were not observed in symptomatic YAC128 mice. Therefore, the behavioral changes present in the early and late stages of HD do not seem to be related to changes in mitochondrial function. However, a neuronal degenerative process was found both in the striatum and hippocampal DG region, as evidenced by the ultrastructural alterations present in granule cells (i.e., robust dilation of both the ER and Golgi apparatus). Regarding possible pharmacological strategies, chronic treatment with probucol was able to prevent the depressive-like behavior in YAC128 mice in the early stages of the disease. These effects were independent of their action on hippocampal structural plasticity. The results presented here reinforce the progressive character of HD and confirm the use of the YAC128 mice as a tool to study disease progression and the potential therapeutic properties of various pharmacological strategies.