Atraso de aprendizagem em modelos experimentais de acidemia glutárica tipo-I e o envolvimento de parâmetros colinérgicos e células gliais na apoptose neuronal: possível proteção da N-acetilcisteína

Abstract

A acidemia glutárica tipo I (AG-I) é uma doença hereditária neurometabólica caracterizada pelo acúmulo de ácido glutárico (AG) nos tecidos e fluídos corporais dos pacientes. Essa patologia apresenta uma prevalência mundial estimada de 1 a cada 106.000 recém-nascidos. As crianças com AG-I podem desenvolver graves sintomas neurológicos, como comprometimento motor e também vários graus de deficiência intelectual e problemas comportamentais. Esses sintomas, frequentemente, surgem após crises encefalopáticas, mas também aparecem de forma progressiva na ausência das crises. Acredita-se que danos neuropatológicos como atrofia estriatal bilateral e atrofia cortical progressiva estejam subjacentes aos prejuízos neurológicos. No entanto, ainda não está claro o mecanismo pelo qual o AG leva a morte neuronal e os prejuízos cognitivos. Sendo assim, sabendo que há relevante disfunção estriatal na AG-I e que esta estrutura está envolvida no controle de processos cognitivos relacionados à aprendizagem de procedimentos e hábitos, este estudo propôs investigar mecanismos que levam ao dano estriatal e vias de morte neuronal, bem como possíveis prejuízos cognitivos induzidor pelo AG, através de 2 modelos experimentais de AG-I. Também investigamos se o tratamento com N-acetilcisteína (NAC) poderia melhorar as alterações dos parâmetros comportamentais, bioquímicos e moleculares induzidos pelo AG. Para isso, inicialmente, foi utilizado modelo de injeção crônica de AG. Esse modelo mimetiza uma situação de exposição contínua ao AG. Dessa forma, ratos jovens foram injetados com AG (5 µmol/g, s.c., duas vezes ao dia do 5º ao 28º dia de vida) e foram tratados com NAC (150 mg/kg, por gavagem intragástrica, do 5º ao 28º dia). Observamos que a injeção crônica de AG causou atraso na aprendizagem procedimental, observado no labirinto radial de 8 braços e no labirinto aquático de Morris (LAM). Também verificamos um aumento na concentração de citocinas, de marcadores oxidativos, nos níveis de caspases ativadas e na atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado dos animais. Interessantemente, encontramos aumento na imunorreatividade de células gliais e diminuição na imunorreatividade do receptor colinérgico nicotínico alfa7 (a7nAChR) e de NeuN no estriado. Estes resultados sugerem que a toxicidade crônica do AG possa estar acontecendo através da ativação de células gliais, inflamação e estresse oxidativo, além de indicar possível comprometimento na sinalização colinérgica estriatal. No entanto, a administração de NAC protegeu do prejuízo cognitivo, do dano oxidativo, da neuroinflamação e da ativação de caspases induzida por AG. Apesar de não ter prevenido a morte neuronal, o tratamento com a NAC protegeu das alterações induzidas pela injeção crônica de AG na imunorreatividade de Iba-1 e GFAP e na atividade da AchE. Esses resultados sugerem que a exposição contínua ao AG gera uma neurotoxicidade estriatal, possivelmente por ativação de células gliais e comprometimento na sinalização colinérgica, capaz de alterar processos cognitivos dependentes dessa estrutura. Posteriormente, investigamos se os danos neurológicos também seriam desencadeados por apenas um aumento transiente de AG. Assim, avaliamos se uma exposição aguda ao AG, o que mimetiza uma crise de descompensação metabólica, durante o período neonatal poderia ativar processos apoptóticos e levar a posterior prejuízos na memória de procedimento. Para isso, camundongos foram injetados, entre 12 e 24 horas após o nascimento, com AG (2,5 µmol/g, pH 7,4, i.c.v.) e/ou salina 0,9%, e foram tratados com NAC (250 mg/kg, i.p.) e/ou salina 0,9%, uma vez ao dia, do 2º ao 21º dia de vida. A partir de 21 ou 40 dias de vida, os animais foram avaliados no labirinto radial de 8 braços e no LAM para análise da memória de procedimento e memória de trabalho. Observamos que animais injetados com AG apresentaram déficit na aprendizagem de procedimentos (animais com 21 ou 40 dias de vida), mas a memória de trabalho foi prejudicada apenas em camundongos com 40 dias de idade. Verificamos também que houve ativação de células gliais no estriado induzidas por AG (GFAP e Iba-1) e aumento da peroxidação lipídica. Uma vez que as células gliais fornecem suporte trófico para os neurônios, avaliamos a concentração de NGF, neurotrofina importante para neurônios colinérgicos. Assim, observamos diminuição na concentração de NGF estriatal, e aumento da imunoreatividade do receptor de morte ativado por neurotrofinas, p75NTR. Concomitantemente, verificamos diminuição na imunorreatividade de NeuN estriatal, embora moduladores apoptóticos não tenham sido alterados (clivagem da PARP e Bcl-2). Interessante, a administração de NAC protegeu da peroxidação lipídica, da ativação das células gliais e do aumento de proteínas pró-apoptóticas, bem como foi eficaz contra a morte neuronal no estriado dos animais que receberam injeção aguda de AG. Já no córtex dos animais, observamos aumento na ativação de Iba-1, porém a astrogliose reativa ocorreu apenas nos animais com 21 dias de vida. O aumento na peroxidação lipídica, p75NTR, PARP clivada/PARP total e diminuição de Bcl-2 e NGF resultaram na morte neuronal cortical induzida pela exposição aguda ao AG. O tratamento com a NAC protegeu de todas alterações nos animais cm 21 dias de vida, mas não do aumento de p75NTR e GFAP nos animais com 40 dias de vida. Embora não tenha sido capaz de proteger contra todas as alterações corticais induzidas pelo AG, o tratamento com NAC foi eficaz na proteção do atraso da aprendizagem de procedimentos apresentado pelos animais. Em conjunto, esses dados sugerem que tanto o insulto agudo quanto o crônico podem causar comprometimento cognitivo relacionado a memória de procedimentos, devido à morte neuronal estriatal e cortical, o que pode prejudicar a plasticidade necessária para a aprendizagem e desempenho das funções cognitivas. Provavelmente, a morte neuronal está sendo desencadeada pelo aumento do receptor de morte p75NTR, aumento da clivagem da PARP, o desequilíbrio em parâmetros do sistema colinérgico, juntamente com estresse oxidativo e inflamação. Além disso, como o AG provoca disfunção astrocitária e ativação microglial, e essas células são extremamente importantes para o desenvolvimento e sobrevivência de neurônios produzindo e liberando fatores neurotróficos, como NGF, a morte neuronal também pode estar ocorrendo por disfunção astrocitária e diminuição de NGF. Adicionalmente, o tratamento com a NAC foi capaz de melhorar as alterações comportamentais e moleculares induzidas pelo AG. Dessa forma, sugerimos uma possível via de degeneração estriatal através da toxicidade as células gliais, bem como uma estratégia terapêutica que poderia contribuir no tratamento dos pacientes com AG-I.

Abstract: Glutaric acidemia type I (GA-I) is a hereditary neurometabolic disease characterized by the accumulation of glutaric acid (GA) in the tissues and body fluids of patients. This disease presents an estimated worldwide prevalence of 1 in 106,000 newborns. Children with GA-I may develop severe neurological symptoms such as motor impairment and also varying degrees of intellectual impairment and behavioral problems. These symptoms often arise after encephalopathic seizures, but also appear progressively in the absence of seizures. Neuropathological damage such as bilateral striatal atrophy and progressive cortical atrophy are believed to underlie neurological impairment. However, the mechanism by which GA leads to neuronal death and cognitive impairment remains unclear. Thus, knowing that there is relevant striatal dysfunction in GA-I and that this structure is involved in the control of cognitive processes related to learning procedural and habits, this study proposed to investigate mechanisms that lead to striatal damage and neuronal death pathways, as well as possible cognitive impairment induced by GA, through 2 experimental models of GA-I. We also investigated whether treatment with N-acetylcysteine (NAC) could improve the changes in behavioral, biochemical and molecular parameters induced by GA. For this, initially, a model of chronic injection of GA was used. This model mimics a situation of continuous exposure to GA. Thus, pup rats were injected with GA (5 µmol/g, s.c., twice daily from the 5th to the 28th day of life) and were treated with NAC (150 mg/kg, intragastric gavage from the 5th to the 28th day). We observed that the chronic injection of GA caused a delay in procedural learning in the Radial Arm-Maze task and Water Maze task. We also observed an increase in the cytokines concentration, oxidative markers, activated caspase levels and acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum of the animals. Interestingly, an increase in glial cell immunoreactivity and a decrease in the immunoreactivity of nicotinic receptor cholinergic alpha7 (a7nAChR) and NeuN in the striatum were found. These results suggests that the chronic toxicity of GA may be dependent on activation of glial cells, inflammation and oxidative stress, besides indicates a possible compromise in striatal cholinergic signaling. However, administration of NAC protected against cognitive impairment, oxidative damage, neuroinflammation and activation of caspases induced by GA. Although NAC did not prevent neuronal death, it protected from changes induced by chronic injection of GA in the immunoreactivity of Iba-1 and GFAP and in AChE activity. These results suggest that continuous exposure to GA generates striatal neurotoxicity, possibly by activation of glial cells and impairment of cholinergic signaling, which may alter cognitive processes dependent on this structure. Subsequently, we investigated whether neurological damage would also be triggered by only a transient increase in GA. Thus, we evaluated whether an acute exposure to GA, which mimics a crisis of metabolic decompensation, during the neonatal period could activate apoptotic processes and lead to subsequent impairment on procedural learning. For this, mice were injected with GA (2.5 µmol/g, pH 7.4, i.c.v.) and/or saline 0.9%, from 12 to 24 hours after birth, and were treated with NAC (250 mg/kg, i.p.) and/or saline 0.9%, once daily, from the 2nd to the 21st day of life. From 21 or 40 days of life, the animals were evaluated in the RAM and in Water maze task for analysis of the procedural and working memory. We observed that animals injected with GA presented deficits in procedural learning (21- and 40-day-old mice), but working memory was impaired only in 40-day- old mice. We also verified that GA induced glial cells activation (GFAP and Iba-1) and increased lipid peroxidation. Since glial cells provide trophic support to neurons, we evaluated NGF concentration, important neurotrophin for cholinergic neurons. Thus, we observed a decrease in striatal NGF concentration, and increased in immunoreactivity of p75 neurotrophin receptor (p75NTR). Concomitantly, we found a decrease in the immunoreactivity of striatal NeuN, although apoptotic modulators were not altered (cleavage PARP and Bcl-2). Interestingly, NAC administration protected lipid peroxidation, glial cell activation, and pro- apoptotic protein enhancement, as well as being effective against striatal neuronal death in animals receiving acute AG injection. In the cortex, we observed an increase in Iba-1 activation, but reactive astrogliosis occurred only in 21-day-old mice. The increase in lipid peroxidation, p75NTR, cleaved PARP / total PARP and decrease of Bcl-2 and NGF resulted in cortical neuronal death induced by acute exposure to GA. And the treatment with NAC protected from all changes in 21-day-old mice, but not from the increase of p75NTR and GFAP in 40-day-old mice. Although not able to protect against all cortical alterations induced by GA, NAC treatment was effective in protecting the delayed procedural learning presented by animals. Taken together, these data suggest that both acute and chronic insults may cause cognitive impairment related to procedural memory due to striatal and cortical neuronal death, which may impair the plasticity required for learning and performance of cognitive functions. Probably, neuronal death is being triggered by increased p75NTR death receptor, increased PARP cleavage, imbalance in parameters of the cholinergic system, along with oxidative stress and inflammation. In addition, as GA causes astrocytic dysfunction and microglial activation, and these cells are extremely important for the development and survival of neurons producing and releasing neurotrophic factors such as NGF, neuronal death may also be occurring by astrocytic dysfunction and decreased NGF. In addition, treatment with NAC was able to improve the behavioral and molecular changes induced by GA. Thus, we suggest a possible pathway of striatal and cortical degeneration through glial cell toxicity, as well as a therapeutic strategy that could contribute to the treatment of patients with AG-I.