Estratégia de manutenção de colônia de camundongos geneticamente modificados

Abstract

A criação de camundongos transgênicos representou um enorme avanço para a ciência. O sistema Cre-Lox, é um sistema de edição genética através da recombinação de DNA sítio-específica. A enzima Cre recombinase reconhece sítios LoxP e é capaz de provocar uma deleção, inversão ou translocação do gene localizado entre dois sítios. O gene da enzima pode ser controlado por um promotor sítio-específico e tem ainda a possibilidade de ser induzível, permitindo assim um controle temporal e espacial do gene flanqueado. A droga utilizada para indução do sistema é o tamoxifeno, um modulador seletivo do receptor do estrogênio (MSRE). Os alvos moleculares selecionados para o presente estudo foram as proteínas p53, PTEN e BRCA1, que pertencem à grande família das proteínas supressoras de tumor (PSTs). Elas previnem a formação de tumores no organismo agindo de diversas formas: impedindo o crescimento e proliferação celular, na apoptose e no controle do reparo do DNA, entre outros. Além disso, as PSTs tem sido descritas como importantes moduladoras de funções do sistema imune. Sendo assim, o presente trabalho é de especial relevância para futuros projetos do Laboratório de Imunoregulação (iREG), que estuda, principalmente, mecanismos de regulação do sistema imune pela microbiota comensal. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi de estabelecer, manter e expandir colônias de animais transgênicos complexos com 2, 3 e até 4 transgenes, através de cruzamentos estratégicos para obter animais suficientes para manutenção das colônias e formação de grupos experimentais. As linhagens parentais (K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP, BRCA1LoxP) foram recebidas pelo iREG como doação do National Institutes of Health dos Estados Unidos da América. Seguiu-se protocolos padrão de procedimentos de atenção a camundongos de experimentação no biotério setorial do MIP, assim como de extração de DNA genômico, e genotipagem descritos pelo The Jackson Laboratory para essas linhagens. As colônias de animais K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP e BRCA1 de genótipo individual foram cuidadas ao longo de dois anos. Para isso foi necessário genotipar cada um dos filhotes gerados pelos animais parentais dessas linhagens, separa-los segundo gênero e promover seu cruzamento de acordo a facilidade de procriação e espaço físico disponível no biotério, para novamente iniciar um ciclo seguinte de cruzamento, procriação e genotipagem dos filhotes. Dos 4 genótipos iniciais, foi possível identificar, manter e expandir 3 colônias com sucesso (K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP) e ainda foi possível gerar novas colônias com genótipos em combinação (K14CreERT+/PTENLoxP+/+; K14CreERT+/PTENLoxP+/-; PTENLoxP+/-/p53LoxP+/-; K14CreERT+/p53LoxP+/-; K14CreERT+/PTENLoxP+/-/p53LoxP+/-). No entanto, o genótipo BRCA1 mostrou-se de difícil procriação pelo que não foi possível manter essa colônia. Também foi realizada uma tentativa de indução da ativação da Cre para deleção de PTEN (em animais PTENLoxP +/-/K14CreERT +) usando tamoxifeno, na sua forma de uso clínico (citrato de tamoxifeno) e não na forma 4-H. No entanto, os resultados dessa indução de Cre não foram conclusivos. Em conclusão, as colônias obtidas mostram-se promissoras para a manutenção das mesmas e sua aplicação em futuros trabalhos do iREG, no entanto, foi também evidenciada a grande necessidade de melhora das condições de suporte institucional aos biotérios na nossa universidade.

The creation of transgenic mice represented a huge breakthrough for Science. The Cre-Lox system is a genetic editing system based on site-specific DNA recombination. The Cre recombinase enzyme recognizes LoxP sites and is capable of promoting deletion, inversion or translocation of the gene located between two LoxP sites. The enzyme gene can be controlled by a site-specific promoter and has the possibility of being inducible; thus, allowing temporal and spatial control of the flanked gene. The drug used to induce the system is tamoxifen, a selective estrogen receptor modulator (SERM). The molecular targets selected for the present study were p53, PTEN and BRCA1 proteins, which belong to the large family of tumor suppressor proteins (TSPs). They prevent the formation of tumors in the host in various ways: promoting the prevention of cell growth and proliferation, in apoptosis outset, in the control of DNA repair among other mechanisms. In addition, TSPs have been described as important modulators of immune system functions. Therefore, the present study is of special relevance for future projects of the Laboratory of Immunoregulation (iREG), which focus its research on mechanisms of regulation of the immune system by commensal microbiota. Consequently, the objective of the present work was to establish, maintain and expand colonies of complex transgenic animals with 2, 3 and up to 4 transgenes, through strategic crossings to obtain sufficient animals for colony maintenance and formation of experimental groups. The parental lines (K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP, BRCA1LoxP) were received by the iREG as a donation from the National Institutes of Health of the United States of America. Standard protocols were followed for both, maintenance procedures for experimental mice in the MIP sectorial facility, as well as for genomic DNA extraction and genotyping described by The Jackson Laboratory for these strains. The colonies of single genotype K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP and BRCA1 were followed over two years. For this purpose, it was necessary to genotype each of the pups generated by parental animals of these strains, to separate them according to gender and promote their crossing according to the readiness of breeding and availability of physical space in the vivarium, to start again a next cycle of breeding and genotyping of the pups. Of the initial 4 initial genotypes, it was possible to successfully identify, maintain and expand 3 colonies (K14CreERT, p53LoxP, PTENLoxP) and from them, to generate new colonies with combined genotypes (K14CreERT+/PTENLoxP+/+; K14CreERT+/PTENLoxP+/-; PTENLoxP+/-/p53LoxP+/-; K14CreERT+/p53LoxP+/-; K14CreERT+/PTENLoxP+/-/p53LoxP+/-). However, the BRCA1 genotype was difficult to breed so it was not possible to maintain this colony. An attempt of PTEN deletion was also performed by inducing Cre activation (in PTENLoxP + / - / K14CreERT + animals) using tamoxifen as tamoxifen citrate (the clinical form of the drug available in pharmacies) rather than as 4-HT. However, the results of this Cre induction attempt were not clear. In conclusion, the colonies obtained are promising for their maintenance and their application in future research projects of the iREG, however, it was also evidenced the great necessity of institutional support to improve the work conditions to vivariums of our university.