Efeito citoprotetor de compostos orgânicos de selênio contra o dano oxidativo induzido por peróxido em uma linhagem de célula neuronal HT22: envolvimento do sistema antioxidante dependente de glutationa

Abstract

O estresse oxidativo celular é um fator importante no desenvolvimento de várias doenças neurodegenerativas, especialmente as doenças de Alzheimer e de Parkinson. Dentre as regiões do encéfalo, o hipocampo, estreitamente ligado à memória e cognição, é comumente afetado em várias doenças neurodegenerativas. Na última década, um especial interesse tem sido dado ao estudo de compostos com propriedades protetoras que permitem prevenir ou reduzir o dano oxidativo nestas doenças neurodegenerativas. Neste contexto, no presente estudo foram avaliados os efeitos protetores de dois compostos orgânicos de selênio, (PhSe)2 e RC513, em uma cultura de células neuronais hipocampais HT22 expostas ao hidroperóxido de terc-butila (tBuOOH) (modelo de estresse oxidativo in vitro), bem como os mecanismos moleculares envolvidos na citoproteção. As células HT22 foram pré-tratadas com 2 µM de (PhSe)2 ou RC513 durante 48 horas e posteriormente expostas a tBuOOH (40 µM) durante: i) 12 h para avaliar a viabilidade e morte celular utilizando o ensaio MTT e IP; ii) 2-4 h para avaliar a taxa de consumo de oxigênio, usando respirometria de alta resolução; e iii) 2-4 h para avaliar a geração de espécies oxidantes usando H2DCFDA e MitoSOX. Os níveis de transcritos de Gpx1 e Gclc e atividade da glutationa peroxidase (GPx), níveis de glutationa (GSH) e tióis não proteicos (NPSH) também foram avaliados nas células HT22 após o pré-tratamento com (PhSe)2 ou RC513. O perfil temporal (3 h até 24 h) dos níveis de transcritos de genes alvos de Nrf2 e FoxO (Prdx2, Prdx3, Prdx5, Txnrd2, Sod2, Cat, HO-1, Gpx1 e Gclc) também foi avaliado. Os resultados mostram que o RC513 aumentou a expressão dos genes Gpx1, Prdx2 e Prdx5, enquanto o (PhSe)2 incrementou a expressão dos genes Gpx1, Cat, HO-1 e Gclc. Estes resultados sugerem que ambos compostos ativam as vias de sinalização Nrf2 e/ou FoxO nestas células. Ambos os compostos foram capazes de proteger as células HT22 contra o estresse oxidativo induzido pelo tBuOOH. A citoproteção mediada pelos compostos foi acompanhada da habilidade de ambos em reduzir a geração de oxidantes e prevenir a disfunção mitocondrial. O pré-tratamento das células com ambos compostos aumentou a atividade GPx e os níveis de transcritos do gene Gpx1. Alguns efeitos distintos foram verificados, como por exemplo, o (PhSe)2 além de aumentar a atividade GPx, este composto modulou positivamente os transcritos da Gclc correlacionando-se com o incremento dos níveis de GSH e NPSH nas células HT22, enquanto o RC513 não induziu modificações nestesparâmetros. Adicionalmente avaliamos o efeito do (PhSe)2 e do RC513 (0,5 µM e 2 µM) sobre a citotoxicidade induzida por outros agentes estressores (SIN-1, glutamato e MeHg). Os resultados indicaram que o pré-tratamento com (PhSe)2 ou RC513 (2 µM) evitou a dimunuição da viabilidade celular após exposição ao tBuOOH (400 µM), SIN-1 (2 mM), glutamato (10 mM) e MeHg (1000 nM). Um curto período de pré-tratamento com RC513 (2 µM, por 3 h) teve uma eficiência protetora melhor do que o (PhSe)2 mantendo a viabilidade celular após a exposição prolongada ao tBuOOH (40 µM). Alem disso, RC513 (0,5 µM) foi mais efetivo do que (PhSe)2 na citoproteção frente ao tBuOOH (40 µM), glutamato (5 mM) e MeHg (1000 nM). Em resumo, este estudo demonstra, pela primeira vez, os efeitos protetores dos compostos (PhSe)2 e RC513 em células neuronais HT22 expostas a oxidantes, mostrando algumas diferenças no mecanismo de proteção destes compostos. Os resultados do presente estudo sugerem e indicam que estes compostos são promissores como agentes neuroprotetores em condições relacionadas ao estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial.

Abstract : Cellular oxidative stress is an important factor in the development of various neurodegenerative diseases, especially Alzheimer's and Parkinson's diseases. Among the regions of the brain, the hippocampus, closely linked to memory and cognition, is commonly affected in several neurodegenerative diseases. In the last decade, a special interest has been given to the study of compounds with protective properties that allow preventing or reducing oxidative damage in these neurodegenerative diseases. In this context, the protective effects of two organic selenium compounds (PhSe)2 and RC513 were evaluated in a culture of HT22 hippocampal neuronal cells exposed to tert-Butyl hydroperoxide (tBuOOH) (in vitro oxidative stress model), as well as the molecular mechanisms involved in their cytoprotection. HT22 cells were pretreated with 2 µM of (PhSe)2 or RC513 for 48 hours and then exposed to tBuOOH (40 µM) for: i) 12 h to assess viability and cell death using the MTT and PI assay; ii) 2-4 h to evaluate the oxygen consumption rate (OCR), using high-resolution respirometry; and iii) 2-4 h to evaluate the generation of oxidant species using H2DCFDA and MitoSOX. Levels of Gpx1 and Gclc transcripts and Glutathione peroxidase (GPx) activity, glutathione (GSH) and the non-protein sulfydryls (NPSH) levels were also evaluated in HT22 cells after pre-treatment with (PhSe)2 or RC513. The time profile (3 h to 24 h) of transcript levels of Nrf2- and FoxO-target genes (Prdx2, Prdx3, Prdx5, Txnrd2, Sod2, Cat, HO-1, Gpx1 and Gclc) was also evaluated. The results show that RC513 increased the expression of Gpx1, Prdx2 and Prdx5, while (PhSe)2 increased expression of the Gpx1, Cat, HO-1 and Gclc. These results suggest that both compounds activate the Nrf2 and/or FoxO signaling pathways in these cells. Both compounds were able to protect HT22 cells against the oxidative stress induced by tBuOOH. The cytoprotection mediated by the compounds was accompanied by the ability to both reduce the generation of oxidants and to prevent mitochondrial dysfunction. Pretreatment of the cells with both compounds increased the activity of GPx and the transcript levels of the Gpx1 gene. Some distinct effects were verified, such as (PhSe)2 in addition to increasing GPx activity, this compound positively modulated Gclc transcripts correlating with the increase of GSH and NPSH levels in HT22 cells, while RC513 did not induced changes in these parameters. Additionally, we evaluated the effect of (PhSe)2 and RC513 (0.5 µM and 2 µM) on cytotoxicity induced by other stressors (SIN-1, glutamate and MeHg). The results indicated that pre-treatment with (PhSe)2 or RC513 (2 µM) prevented the decrease in cell viability after exposure to tBuOOH(400 µM), SIN-1 (2 mM), glutamate (10 mM) and MeHg (1000 nM). A short pretreatment period with RC513 (2 µM, for 3 h) had a better protective efficiency than (PhSe)2 in maintaining cell viability after prolonged exposure to tBuOOH (40 µM). In addition, RC513 (0.5 µM) was more effective than (PhSe)2 on cytoprotection against tBuOOH (40 µM), glutamate (5 mM) and MeHg (1000 nM). In summary, this study demonstrates, for the first time, the protective effects of compounds (PhSe)2 and RC513 on HT22 neuronal cells exposed to oxidants, showing some differences in the mechanism of protection of these compounds. The results of the present study suggest and indicate that these compounds are promising as neuroprotective agents under conditions related to oxidative stress and mitochondrial dysfunction.