Variações genômicas e longos trechos contínuos de homozigose detectados por Array-CGH em pacientes com distúrbios do desenvolvimento cerebral: interpretação e implicações

Abstract

Os distúrbios do desenvolvimento cerebral (DDC) são um grupo de doenças heterogêneas que inclui predominantemente a deficiência intelectual (DI) e/ou transtorno do espectro do autismo (TEA), sendo muitas vezes sindrômicos, e afetam em torno de 3-4% da população mundial. Centenas de genes e muitas alterações cromossômicas são associadas aos DDCs, porém cerca de 40% permanece sem esclarecimento etiológico. A técnica de citogenética molecular mais recomendada como exame genético de primeira escolha na avaliação da variação do número de cópias (CNVs) em pacientes com DDC é a técnica de hibridização genômica comparativa por arrays (array-CGH). As plataformas de array-CGH combinam sondas de oligonucleotídeos para detecção de CNVs com sondas para polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que detectam regiões homozigóticas como os longos trechos contínuos de homozigose (LCSHs), fornecendo evidencias para investigação de dissomia uniparental (UPD) e consanguinidade. O presente trabalho teve como objetivo analisar e interpretar o significado clínico das CNVs, bem como avaliar as frequências e as implicações dos LCSHs detectados por array-CGH em exames realizados no Laboratório de Genética Humana Neurogene de Florianópolis. Estes exames foram solicitados entre os anos de 2013 a 2016 por médicos geneticistas e neurologistas de Santa Catarina para a investigação de pacientes com DDC, alguns destes exames (2%) são de familiares não afetados. Este trabalho é um estudo retrospectivo-prospectivo onde foram analisados 430 exames de array-CGH, com as plataformas CytoScan® HD (74%) e CytoScan® 750K (26%). A média de idade dos investigados foi de 9,5 anos (0 a 49 anos); 60% masculinos e 40% femininos, as informações clínicas e fenotípicas para relação fenótipo/genótipo foram fornecidas através de preenchimento de questionários pelos seus médicos e as análises foram feitas no software Chromosome Analysis Suite (Affymetrix®, EUA), com informações de bancos de dados públicos e privados. Resultados: analisando 420 pacientes com DDC para CNVs, foram detectadas um total de 96 CNVs interpretadas como patogênicas em 18% dos casos, em 12% foram detectadas variantes de significado clínico incerto (VOUs) e 70% dos exames não revelaram CNVs de relevância clínica. A análise de fenótipos dessa população revelou que 67% dos participantes apresentou atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM), 41% participantes tinha com deficiência intelectual DI (incluindo muitos que apresentaram ADNPM), em conjunto representando 80% (ADNPM e/ou DI), 52% tinham dismorfias faciais e 32% TEA. Conforme análise univariada, os fenótipos preditivos de um resultado patogênico em indivíduos com DCC foram em ordem decrescente; obesidade (p-value = 0.006), baixa estatura (p-value = 0.032), anomalias e malformações geniturinárias (p-value = 0.032) e TEA (p-value = 0.039). Todos os 430 exames (incluindo alguns familiares não afetados) foram investigados para a presença de LCSHs (regiões de homozigose em cromossomos autossômicos = do que 3 Mb), sendo que 95% dos participantes apresentaram de um a vários LCHS, somando um total de 1.478 LCSHs identificados. Para 10 casos (2,3%), os achados foram sugestivos de UPD. Cerca de 26% dos casos indicaram endogamia, dos quais 8% sugerem descendência de primeiro a quinto grau, que são mais propensos a causar um impacto clínico. Considerando LCSHs encontrados em uma frequência acima de 5% em indivíduos com DDC, foram delineadas algumas regiões consideradas homozigotas por representarem potenciais haplótipos ancestrais comuns na população de SC. A região mais comumente envolvida com homozigose foi 16p11.2p11.1 (49%), seguida de 1q21.2q21.3 (21%), 11p11.2p11.12 (19%), 3p21.31p21.2 (16%), 15q15 .1q21.1 (12%), 2q11.1q12.1 (9%), 1p33p32.3 (6%), 20q11.21q11.23 (6%), 10q22.1q23.31 (5%), 6p22.2p22.1 (5%) e 7q11.22q11.23 (5%). A taxa diagnóstica encontrada neste estudo foi de 18% e está dentro da relatada na literatura (15-20%), sendo que a interpretação de LCSHs sozinha não elevou a taxa diagnóstica, porém foi importante para direcionar a investigação posterior, além de permitir um insight para os LCSHs potencialmente ancestrais da população de SC. A interpretação clínica de CNVs encontradas e as implicações do LCSH ainda são um desafio e dependem, em grande parte, das informações de frequência e detecção em coortes com amostragem significativa, como a relatada neste estudo.

Abstract : Brain developmental disorders (BDD) are a heterogeneous group of diseases that predominantly include intellectual disability (ID) and/or Autism Spectrum Disorder (ASD), often syndromic, affecting around 3-4% of the world's population. Hundreds of genes and many chromosomal abnormalities are associated with BDD, however for about 40% the causes remain unclear. The molecular cytogenetic technique of comparative array genomic hybridization (array-CGH) is recommended as the first-tier genetic test for BDD and investigates genomic copy number variations (CNVs). Modern array-CGH platforms combine oligonucleotide probes for detection of CNVs with probes for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that detect homozygous regions such as long continuous stretches of homozygosity (LCSHs), providing evidence for uniparental disomy (UPD) and consanguinity. The aim of the present study was to analyze and interpret the clinical significance of CNVs, as well as to evaluate the frequencies and the implications of LCSHs detected by array-CGH in tests performed at the Neurogene Human Genetics Laboratory of Florianópolis. Requested between 2013 to 2016 by geneticists and neurologists from Santa Catarina to investigate patients with CDD, some tests (2%) are from unaffected relatives. A total of 430 array-CGH exams were analyzed with the CytoScan® HD (74%) and CytoScan® 750K (26%) platforms. The mean age of the subjects was 9.5 years (0 to 49 years); 60% male and 40% female. It is a retrospective-prospective study. Clinical and phenotypic information for phenotype/genotype relationship were accessed through questionnaire completion by their physicians. The analyzes were done in the Chromosome Analysis Suite software (Affymetrix®, USA) and with information from public and private databases. Results: The analysis of the CNVs o the 430 participants revealed a total of 96 pathogenic CNVs, 18% of the cases. For 12% of the participants variants of uncertain clinical significance (VOUs) were found and for 70%,the exams did not reveal CNVs of clinical relevance. Analysis of phenotypes of this population revealed that 67% presented delayed neuropsychomotor development and41% had ID (some of which also had delayed neuropsychomotor devlopment), together representing 80%; 52% had facial dysmorphia and 32% TEA. According to univariate analysis, the predictive phenotypes of a diagnostic outcome in individuals with BDD were, in descending order; obesity (p-value = 0.006), short stature (p-value = 0.032), anomalies and genitourinary malformations (p-value = 0.032) and TEA (p-value = 0.039). All 430 exams (including some unaffected relatives) were investigated for the presence of LCSHs (homozygous regions on autosomal chromosomes = 3 Mbp), of which 95% of the participants had one to several LCHS, summing up a total of 1,478 LCSHs. For 10 cases (2.3%) the findings were suggestive of UPD. For about 26% of the cases, LCSHs indicated endogamy, of which 8% suggest descent from first to fifth grade, which are more likely to have a clinical impact. LCSHs found at a frequency above 5% in individuals with BDD, were considered to be homozygous for potentially representing common ancestral haplotypes in the SC population. The region most commonly involved with homozygosity was 16p11.2p11.1 (49%), followed by 1q21.2q21.3 (21%), 11p11.2p11.12 (19%), 3p21.31p21.2 (16%), 15q15 .1q21.1 (12%), 2q11.1q12.1 (9%), 1p33p32.3 (6%), 20q11.21q11.23 (6%), 10q22.1q23.31 (5%), 6p22.2p22.1 (5%) and 7q11.22q11.23 (5%). The diagnostic rate in this study was 18% and is within the reported in the literature (15-20%). The interpretation of LCSHs by itself did not raise the diagnostic rate, but was important to direct further investigation, besides allowing an insight into the potentially ancestral LCSHs of the SC population. The clinical interpretation of the CNVs found and the implications of LCSH are still a challenge and depend largely on frequency and detection information in cohorts with significant sampling, as reported in this study.