Transporte e fermentação de xilose, celobiose e xilobiose por leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes

Abstract

Saccharomyces cerevisiae é o organismo mais amplamente utilizado pela indústria de produção de bioetanol, mas não consegue fermentar eficientemente alguns açúcares presentes em hidrolisados da biomassa ligninocelulósica. Uma vez que o limitado transporte de xilose e a inexistência de vias de utilização de xilobiose e celobiose são uns dos principais desafios a serem superados para uma eficiente fermentação destes hidrolisados, neste trabalho identificamos novos transportadores de açúcares e enzimas provenientes de leveduras que naturalmente conseguem utilizar hidrozado de biomassa vegetal, como Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum, Meyrozyma guilliermondii e Candida tropicalis. Uma linhagem de S. cerevisiae hxt-nula, sem os principais transportadores de hexose (hxt1-hxt7 e gal2), mas com altas atividades de xilose redutase, xilitol desidrogenase e xilulocinase, foi transformada com plasmídeos de uma biblioteca genômica de Sc. stipitis ou, alternativamente, com genes de transportadores de açúcares selecionados a partir dos genomas publicados de Sp. passalidarum e Sp. arborariae. Cinco genes permitiram fermentação de xilose e glicose pelas linhagens recombinantes: três genes de S. stipitis (SsXUT1, SsHXT2.6 e SsQUP2), e duas versões truncadas de transportadores provenientes de Sp. arborariae e Sp. passalidarum (tSaXUT1 e tSpXUT1, respectivamente), sendo que o transportador tSpXUT1 foi o que permitiu o melhor desempenho fermentativo com xilose de todos os transportadores clonados. Além disso, novos genes para transportadores e enzimas necessárias para o consumo de xilobiose e celobiose também foram expressos em S. cerevisiae, incluindo uma enzima intracelular (SpBGL2) proveniente de Sp. passalidarum com atividade ß-glicosidase e ß xilosidase. A co-expressão de genes de transportadores (MgCBT2 e CtCBT1) provenientes de M. guilliermondii e C. tropicalis, permitiu o consumo de celobiose por S. cerevisiae. A combinação do transportador MgCBT2 com a enzima SpBGL2 permitiu a eficiente fermentação de celobiose por S. cerevisiae, atingindo rendimento máximo de etanol a partir desta fonte de carbono. Portanto, os resultados obtidos ressaltam a importância dos transportadores de açúcares para a eficiente produção de bioetanol a partir da biomassa lignocelulósica por leveduras S. cerevisiae recombinantes.

Abstract : Saccharomyces cerevisiae is the most widely organism used by bioethanol production industry, but it can not ferment efficiently some sugars present in ligninocellulosic biomass hydrolysates. Since limited xylose transport and the lack of ways to using xylobiose and celobiose are one of main challenges to be overcome for efficient hydrolyzates fermentation, in this work we identify new sugar transporters and enzymes from yeasts that naturally can use plant biomass, such as Scheffersomyces stipitis, Spathaspora arborariae, Spathaspora passalidarum, Meyrozyma guilliermondii and Candida tropicalis. A S. cerevisiae strain without the major hexose transporters (hxt1-hxt7 and gal2), but with high xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulokinase activities, was transformed with plasmids from Sc. stipitis genomic library or, alternatively, with sugar transporter genes selected from published Sp. passalidarum and Sp. arborariae genomes. Five genes allowed xylose and glucose fermentation by recombinant strains: three Sc. stipitis genes (SsXUT1, SsHXT2.6 and SsQUP2), and two truncated transporters versions from Sp. arborariae and Sp. passalidarum (tSaXUT1 and tSpXUT1, respectively), and tSpXUT1 transporter was the one that allowed the best xylose fermentation desempenho of all cloned transporters. In addition, new genes for transporters and enzymes required for xylobiose and celobiose consumption were also expressed in S. cerevisiae, including an intracellular enzyme (SpBGL2) from Sp. passalidarum with ß-glucosidase and ß-xylosidase activity. The co-expression of the transporter genes (MgCBT2 and CtCBT1) from M. guilliermondii and C. tropicalis with intracellular enzyme, allowed celobiose consumption by S. cerevisiae. The combination of MgCBT2 transporter with SpBGL2 enzyme, allowed efficient celobiose fermentation by S. cerevisiae, achieving maximum yield of ethanol from this carbon source. Therefore, the results obtained highlight sugar transporters importance for efficient bioethanol production from lignocellulosic biomass by recombinant yeasts S. cerevisiae.