Desenvolvimento e aplicação de método para avaliação da qualidade de termocicladores

Abstract

A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que utiliza equipamentos termocicladores para sua execução, vem sendo amplamente utilizada em laboratórios e é um método acurado se realizado de forma criteriosa. Considerando a importância do desempenho dos termocicladores para a execução da técnica, este estudo pretende contribuir para a garantia da qualidade e confiança dos resultados obtidos por técnicas de PCR. Assim, os objetivos deste estudo foram verificar a homogeneidade térmica do bloco térmico do termociclador, a temperatura e a duração efetivamente executadas em cada ciclo da reação, bem como avaliar a eficiência de amplificação dos termocicladores por meio de uma PCR-controle, e avaliar a relação entre o desempenho dos termocicladores e suas condições de uso. A avaliação da temperatura foi realizada por meio de um protocolo de verificação da temperatura estática e por meio de um protocolo que mimetiza os ciclos térmicos de uma PCR, utilizando-se micro-termopares. A maioria dos termocicladores verificados apresentou algum tipo de distorção no seu perfil de temperatura, demonstrando perfil curvo ou com overshooting. Variações significativas de temperatura entre as posições verificadas nos blocos térmicos também foram observadas. As temperaturas efetivamente executadas desviaram pelo menos 0,5°C das programadas em todas as etapas avaliadas. A duração efetiva das etapas foi consideravelmente diminuída, chegando a não haver um platô na temperatura programada em alguns casos. Tais alterações não foram desprezíveis, pois resultaram em falhas nos resultados da PCR-controle pela maioria dos termocicladores. Portanto, não há posições melhores ou piores no bloco térmico, há termociclador com funcionamento adequado ou inadequado. Por fim, ressalta-se a importância de os usuários realizarem a verificação da qualidade dos seus termocicladores a fim de conhecerem melhor o desempenho dos equipamentos, contribuindo para maior reprodutibilidade das PCR principalmente nos laboratórios que utilizam diferentes modelos de termocicladores.<br>

Abstract : Polymerase Chain Reaction (PCR) has been widely used in clinical laboratories and in scientific research, being considered a well-established technique if carefully performed. Thermocyclers are essential equipments for PCR execution, which must show good performance. Considering the importance of thermocycler quality control, this research aims to contribute to quality assurance and reliability of the results obtained through PCR. In order to evaluate the quality of thermocyclers at UFSC laboratories, the research aimed to verify the thermal homogeneity in the thermal block, the temperature and duration obtained for each reaction cycle, as well as to evaluate the thermocycler amplification efficiency by means of a PCR control and the relationship between thermocycler performance and its maintenance conditions. Temperature evaluation was done using a protocol for verification of static temperature and another protocol that mimics PCR cycles, all of them using micro thermocouples. Most of the thermocyclers verified presented some type of distortion in their temperature profile, showing a curved profile or overshooting. Significant temperature variations among the positions verified in the thermal blocks were also observed. The effective temperatures deviated at least 0.5°C from those programmed in all stages evaluated. The actual duration of the stages was considerably reduced, not even reading a stable plateau at the programed temperature in some cases. Such changes were not negligible, as they resulted in flaws in the control-PCR in the majority of the thermocyclers. Finally, it is emphasized the importance of users to verify the quality of their thermocyclers in order to know the performance of the equipment, contributing to a greater reproducibility of the PCR, especially among the laboratories that use different models of thermocyclers.