Análise das mutações nos genes FLT3 (DIT e D835) e NPM1 como marcadores moleculares para estratificação do prognóstico em pacientes portadores de leucemia aguda

Abstract

As leucemias agudas (LA) compreendem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas pela rápida e incontrolada expansão clonal de células progenitoras do sistema hematopoiético. Segundo a OMS, características imunofenotípicas, citogenéticas e moleculares, além de outras associações, estão relacionadas ao prognóstico e contribuem para a estratificação das LAs, que é baseada na citogenética e na incidência de mutações gênicas, como as mutações no gene NPM1 e FLT3. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação das mutações nos genes NPM1 e FLT3 (DIT e D835) com outros parâmetros laboratoriais e clínicos em casos de LA, atendidos pelo Serviço de Hematologia (HUUFSC), no período de janeiro de 2012 a setembro de 2014. Entre as 57 amostras encaminhadas ao LOEH, 42 estavam de acordo aos critérios de inclusão. A análise das amostras em relação a essas alterações foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para avaliar a presença de mutações no gene NPM1, foi realizado o sequenciamento da região de interesse. Entre os pacientes diagnosticados com leucemia mieloide aguda (LMA), 30,7% apresentaram a mutação no gene FLT3 (FLT3-DIT: 19,2% e FLT3- D835: 11,5%). Nos pacientes diagnosticados com o subtipo leucemia linfoide aguda (LLA) apenas um caso (7,1%) apresentou a mutação FLT3-D835. Não foi observado associação entre a presença dessas mutações com o subtipo de LA. Porém, observou-se que a presença da mutação foi mais incidente em pacientes com LMA. Os resultados mostram que nos casos onde foi detectada a mutação FLT3-DIT, os pacientes apresentaram tanto pior progressão clínica da doença (P=0,006) quanto menor taxa de sobrevida global (P=0,002). Ainda mais, foi possível observar valores para leucometria, atividade da enzima LDH e porcentagem de blastos maiores em relação àqueles sem a presença da mutação. Esses resultados sugerem que a presença de mutações FLT3-DIT são preditivos de mau prognóstico e atuam de forma independente, pois não foi possível observar associação com os demais fatores prognósticos. Em relação mutação FLT3-D835, não foi possível encontrar associação entre esta variável e os demais parâmetros analisados. Na análise da mutação NPM1 entre os pacientes incluídos no estudo, nenhum apresentou mutações compatíveis às descritas na literatura. No entanto, foi possível detectar uma nova mutação no gene NPM1 em amostras de três pacientes. Apesar do número pequeno de casos, pode-se observar que os pacientes apresentaram fatores prognósticos desfavoráveis como o percentual do número de blastos, leucocitose em dois dos três casos, e foram a óbito antes da primeira remissão. Esses dados sugerem que essa mutação pode ser considerada de mau prognóstico, como as mutações no gene NPM1 do tipo não-A. Entretanto, a avaliação prognóstica requer maior número de casos avaliados para sua elucidação. Esses resultados mostram, que diferentes mutações no gene NPM1 podem não ser raras, e requerem a análise da sequência alvo completa. Assim, outros tipos de alteração podem ser detectadas. No geral, o presente estudo destaca a importância de incluir a investigação de marcadores moleculares na avalição prognóstica dos pacientes portadores de LA no momento do diagnóstico, a fim de que a escolha do protocolo terapêutico seja o mais apropriado.<br>

Abstract : Acute leukemias (ALs) are a heterogeneous group of diseases characterized by a fast and uncontrolled clonal proliferation of hematologic progenitor cells. According to the current classification proposed by WHO, the prognosis is defined by immunophenotypic, cytogenetic and molecular characteristics, which contribute to the stratification of ALs, which is based on cytogenetic and on the incidence of gene mutations, as mutations in NPM1 and FLT3. Thus, the aim of this study was to evaluate the prognostic impact of the association between mutations in NPM1 and FLT3 (DIT and D835) genes with other laboratory and clinical parameters in patients with AL before the first therapy. Patients attended the Hematology Department (UFSC-HU) from January 2012 to September 2014. Among the 57 samples sent to (LOEH), 42 were according to the inclusion criteria. The analysis of the mutations in the samples was performed by polymerase chain reaction (PCR). To assess the presence of mutations in NPM1 gene, it was further carried out the sequencing of the region of interest. Among the patients diagnosed with acute myeloid leukemia (AML) included in this study, 30.7% had mutations in the FLT3 gene (FLT3-DIT: 19.2% and FLT3-D835: 11.5%). Among the patients diagnosed with acute lymphocytic leukemia (ALL), only one patient (7.1%) had a mutation FLT3-D835. There was no association between the presence of these mutations and the LA subtype. However, it was observed that the presence of the mutation was more prevalent in patients with AML. The results show that when the mutation FLT3-DIT was observed, patients had a worse clinical progression (P=0.006) and a reduced overall survival rate (P=0.002). Moreover, patients with this mutation had higher values of white blood cell count, LDH enzyme activity and blasts percentage in relation to those without the mutation. The results suggest that the presence of FLT3-DIT mutations are predictive of a worse prognosis, but they act independently, since it was not observed an association with the other prognostic factors. Regarding NPM1 mutation, none of the patients included in this study showed mutations according to the described in the literature. However, by sequencing analysis, it was possible to detect a new mutation in NPM1 gene in three patient samples. Despite the small number of patients, it may be noted that all three cases had unfavorable prognostic factors such as the percentage of blasts, high white blood cell count in two of the three cases, and all of them died before the first remission. These data suggest that this mutation can be considered as poor prognosis, such as mutations in NPM1 gene non-A type. However, the prognostic evaluation of this new mutation requires a larger number of cases to be fully elucidated. These results show that different mutations in NPM1 gene may not be rare, and require analysis by sequencing of the complete target sequence.Thus, other typesof changes can be detected. Overall, the present study highlights the importance of including the investigation of molecular markers in prognostic evaluation of patients with AL at the diagnosis, so the most appropriate treatment protocol can be chosen.