Estudo do efeito anti-inflamatório do Etanercept utilizando-se o modelo de inflamação por carragenina, na bolsa de ar, em camundongos

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Estudo do efeito anti-inflamatório do Etanercept utilizando-se o modelo de inflamação por carragenina, na bolsa de ar, em camundongos

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Title: Estudo do efeito anti-inflamatório do Etanercept utilizando-se o modelo de inflamação por carragenina, na bolsa de ar, em camundongos
Author: Mattei, Rodrigo Antônio
Abstract: A artrite reumatoide é uma doença inflamatória crônica de caráter autoimune que atinge cerca de 1% da população mundial. O desenvolvimento dos medicamentos inibidores do TNF-a na última década representou um grande avanço no tratamento das formas moderadas e severas da atrite reumatoide. O Etanercept é um medicamento que compete com o receptor do TNF-a pela ligação desta citocina. Este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito anti-inflamatório do etanercept utilizando o modelo murino de inflamação induzida pela carragenina na bolsa de ar. Para isso foi realizada a contagem total de leucócitos no fluído da bolsa de ar utilizando-se contador celular automatizado (Auto Hematology Analyzer BC-2800 VET, henchen Mindray Bio-Medical electronic CO Ltda., Hamburger, Germany). A contagem diferencial celular foi realizada em esfregaços corados com May-grunwald-Giemsa em microscópio óptico comum. A exsudação foi avaliada pela quantificação de azul de Evans (25 mg/kg) administrado por via endovenosa e analisado no fluído da bolsa de ar por metodologia colorimétrica e em leitor de ELISA. As dosagens das atividades de MPO, ADA e da concentração de NO foram realizadas no fluído da bolsa de ar por metodologias colorimetricas. As citocinas também foram avaliadas no fluído da bolsa de ar por citometria de fluxo usando o kit comercial (Cytometric Bead Array CBA mouse Th1/Th2 Cytokine kit) e os resultados analisados utilizando o software FCAP array®. A fosofrilação da p-65-NF-kB foi realizada no tecido da bolsa de ar com a metodologia de ELISA utilizando-se anticorpos monoclonais. A análise da apoptose em neutrófilos foi realizada no fluído da bolsa de ar por citometria de fluxo utilizando-se os seguintes marcadores: anticorpos anti-CD11-b marcados com PEcy7 e anti-LY-6G marcado com PE para separar a população de neutrófilos ativados, e anexina V marcada com isotiocianato de fluoreceina (FITC) e 7-actinomicina (7-AAD) como marcadores de apoptose e necrose respectivamente. Todos os parâmetros inflamatórios foram avaliados 24h após a indução da inflamação na bolsa de ar. Em todos os experimentos utilizou-se como referência grupos de animais tratados com dexametasona e indometacina. A análise estatística foi realizada pelo teste paramétrico ANOVA, seguido de teste pos-hoc Newmann-Keuls. Para todas as análises foram considerados significativos os valores de P < 0,05. O Etanercept foi capaz de reduzir a concentração leucocitária no fluído da bolsa de ar (P < 0,01) principalmente reduzindo a concentração deneutrófilos (P < 0,01), e a exsudação (P < 0,01). Além disso, o etanercept inibiu a atividade das enzimas MPO (P < 0,01), ADA (P < 0,01) e as concentrações de NOx (P<0,01), também reduziu as concentrações das citocinas IFN-? (P < 0,05), TNF-a (P < 0,01) e IL-17 (P<0,05), também reduziu os níveis de fosforilação do NF-?B (P < 0,05). Por fim o etanercept apresentou um efeito indutor na apoptose em neutrófilos (P < 0,05). Os resultados deste estudo demonstraram que o etanercept apresentou atividade anti-inflamatória possivelmente pela redução da ativação da via do NF-?B, além disso, seu efeito sobre os neutrófilos pode indicar um possível mecanismo pelo qual o tratamento com este medicamento possa apresentar benefícios logo no início da artrite-reumatoide assim como no tratamento de outras doenças inflamatórias onde estas células estejam envolvidas.<br>Abstract : Rheumatoid arthritis is a chronic, autoimmune inflammatory disease affecting 1% of world?s population. The development of the TNF-a inhibitors in the last decade represented a great advance in the treatment of the mild to severe forms of the rheumatoid arthritis. Etanercept is a drug that competes with the TNF-a receptor for the binding of this cytokine. This paper aimed to evaluate the anti-inflammatory effects or etanercept using the carrageenan induced air-pouch model in mice. To achieve this end the total leukocyte content was analyzed in the air-pouch fluid leakage through automated cell counter (Auto Hematology Analyzer BC-2800 VET, henchmen Mindray Bio-Medical electronic CO Ltda., Hamburger, Germany). The differential cell count was analyzed through observation of May-Grunwald-Giemsa colored smears in a common optic microscope. The exudate levels was evaluated through the injection of Evan?s blue dye (25 mg/kg) through intravenous route and the air pouch fluid leakage was analyzed by colorimetric methodology in an EIE plate reader. The analyses of the MPO, ADA activities and NOx concentration were realized in the air-pouch fluid leakage using colorimetric assays. The cytokine concentrations were analyzed in the air-pouch fluid leakage using the commercial kit (Cytometric Bead Array CBA mouse Th1/Th2 Cytokine kit) and the data was analyzed using the FCAP array® software. The p-65-NF-kB phosphorylation was analyzed in the tissue of the air-pouch by EIE methodology using monoclonal antibodies. The neutrophil apoptosis was realized in the air-pouch fluid leakage through flow cytometry using the following antibodies: anti-CD11-b-PEcy7, anti-Ly-6g-PE for the activated neutrophil gating and apoptosis and necrosis was analyzed through anexin V and 7-actinomycin respectively. All the inflammatory parameters were evaluated 24h after the induction of the inflammation in the air pouch. In all experiments groups of animals treated with dexamethasone and indomethacin were used as reference. The statistical analysis was realized by the ANOVA variation test followed by post-hoc Newmann-keuls. For all analyses values of P < 0.05 were considered significant. Etanercept was able to reduce the leukocyte concentration in the air pouch leakage (P < 0.01), mainly by the reduction of neutrophils (P < 0.01), and exudation (P < 0.01). Treatment with etanercept reduced MPO (P < 0.01) and ADA (P < 0.01) activities and NOx ( P < 0.01) concentration, also reduced the concentration of IFN-? (P < 0.05), TNF-a (P < 0.01) and IL-17 (P < 0.05) and reducedthe NF-?B phosphorylation levels (P < 0.05). Finally etanercept presented an apoptosis inducing effect in neutrophils ( P < 0.05). The results of this study showed that etanercept presented anti-inflammatory activity possibly through the reduction of the activation of NF-?B pathways, besides, it?s effect on neutrophils may indicate a possible mechanism through which the treatment with this drug may present benefits in the beginning of rheumatoid arthritis as well in the treatment of other inflammatory diseases with the involvement of these cells.
Description: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015.
URI: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/135405
Date: 2015


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