Avaliação da funcionalidade do gene AGT1 de leveduras industriais Saccharomyces cerevisiae produtoras de álcool combustível

Abstract

Leveduras do gênero Saccharomyces são utilizadas em diversos processos industriais, dentre eles a fermentação da sacarose para a produção de etanol combustível. A utilização da sacarose ocorre pela sua hidrólise extracelular mediada pela enzima invertase codificada pelo gene SUC2. A hidrólise libera glicose e frutose no meio que são internalizadas pelos transportadores de hexoses codificados pelos genes HXT. Entretanto, a presença do transportador de membrana codificado pelo gene AGT1 possibilita o transporte direto da sacarose para o interior da célula onde a mesma é hidrolisada pela invertase intracelular, ou pelas maltases. Apesar das linhagens industriais CAT-1 e PE-2 possuírem o gene AGT1 no seu genoma, este gene parece ser não-funcional nessas linhagens. O objetivo deste trabalho foi sobre-expressar o gene AGT1 das linhagens CAT-1 e PE-2 para avaliar a sua funcionalidade. Para tal, os genes amplificados por PCR foram inseridos no vetor de sobre-expressão pGRSd. Os novos vetores foram utilizados para transformar a levedura LCM003, que não possui o gene AGT1 no seu genoma. Foi observado que as diferenças na composição de nucleotídeos do gene AGT1 das linhagens CAT-1 e PE-2, em relação à linhagem de laboratório S288C, não interfere na atividade do mesmo quando esse está sobre o controle de um promotor forte. Após sequenciar a região promotora do gene AGT1 nas linhagens industriais produtoras de etanol, podemos concluir que a falta de atividade deste gene está relacionada com uma região promotora defeituosa, recentemente descrita também em outras S. cerevisiae utilizadas em processos industriais.

Yeasts of the genus Saccharomyces are used in various industrial processes, including fermentation of sucrose for the production of fuel ethanol. The use of sucrose is mediated by this extracellular hydrolysis by the enzyme invertase encoded by SUC2 gene. The hydrolysis release glucose and fructose in the medium that are internalized by hexose transporters encoded by the HXT genes. However, the presence of membrane transporter encoded by the AGT1 gene enables direct transport of sucrose into the cell where it is hydrolyzed by intracellular invertase, or the maltases. Despite industrial strains CAT-1 and PE-2 having the AGT1 gene in their genome, this gene appears to be nonfunctional in these strains. This work was over-express the gene AGT1 strains CAT-1 and PE-2 to evaluate its functionality. To this end, the genes amplified by PCR were inserted into the vector overexpression pGRSd. The new vectors were used to transform the yeast LCM003, which lacks the AGT1 gene in their genome. It has been observed that differences in the nucleotide composition of the AGT1 gene of the strains CAT-1 and PE-2 compared to laboratory strain S288C does not interfere with activity even when it is under the control of a strong promoter. After sequencing the AGT1 gene promoter in industrial ethanol-producing strains, we conclude that the lack of activity of this gene is linked to a defective promoter region recently described also in other S. cerevisiae used in industrial processes.