Expansão ex vivo de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical e placentário

Abstract

As Células-tronco progenitoras hematopoiéticas (CTPHs) do sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizadas no tratamento de diversas doenças hematológicas neoplásicas ou não. O emprego de CTPHs do SCUP apresenta como principais vantagens a facilidade de obtenção, a ausência de riscos para a mãe e o(a) doador(a), disponibilidade de uso imediato pelo armazenamento de unidades testadas e tipadas para antígeno leucocitário humano (HLA), menor frequência e gravidade da doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) e a não exigência de total paridade na tipagem HLA. Como principais limitações estão o número reduzido de CTPHs que o SCUP pode prover para um transplante em função do volume limitado e a demora na pega do enxerto. Por sua vez, o sucesso do transplante de CTPHs é dependente da dose celular transplantada por kg de peso corporal do receptor, o que praticamente restringe a utilização do SCUP a pessoas com peso corporal até 50 kg. Para suplantar essa limitação têm sido utilizadas estratégias que envolvem o estabelecimento de critérios para a seleção e armazenamento das unidades de SCUP, transplante de mais de uma unidade de SCUP e a expansão ex vivo das CTPHs do SCUP. A cultura das CTPHs sem células do microambiente hematopoiético priva as CTPHs das interações celulares e moleculares que ocorrem no mesmo. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a expansão ex vivo de CTPHs do SCUP, utilizando a co-cultura com células-tronco mesenquimais (CTMs) obtidas da membrana coriônica (MC) e do vilo de placentas humanas para suporte da hematopoiese em ambiente 2D e 3D. Para isso as CTMs foram caracterizadas morfologicamente e imunofenotipicamente (CD73, CD90, CD105, CD34 e CD45) e analisadas quanto à expressão gênica quantitativa das citocinas de interesse hematopoiético SCF, Flt3-L, TPO, IL6, IL16 e SDF1, nas passagens P1, P5 e P10. No SCUP foi realizado hemograma, contagem e separação de células CD34+ e subpopulações e avaliado o potencial clonogênico. Foram investigadas correlações entre os fatores materno-fetais e parâmetros do SCUP, taxas de expansão ex vivo e entre os próprios parâmetros do SCUP. Para expansão ex vivo foram realizadas co-culturas com CTMs da MC em P1 e do vilo em P5, em ambiente 2D e co-culturas com CTMs do vilo em P5, em ambiente 3D constituído de uma matriz de colágeno I e 6-sulfato de condroitina. Os resultados demonstraram que as CTMs da MC e do vilo apresentam características morfológicas e imunofenotípicas típicas de CTMs e expressam as citocinas de interesse hematopoiético, nas três passagens analisadas. As CTMs da MC em P1 e do vilo em P5 apresentaram o melhor perfil de expressão de citocinas e foram selecionadas para os experimentos de expansão ex vivo. A análise das correlações entre os diferentes fatores e parâmetros avaliados sugere a seleção de unidades de SCUP oriundas de doações com idade gestacional acima de 39,5 semanas, contagens de células nucleadas totais (CNT) acima de 13,05 x 106 células por mL, percentagem de eritroblastos (NRBC) maior de 2,875% e com contagem de células CD34+ superiores a 23,73 x 103 células por mL, para obtenção de amostras de melhor conteúdo hematopoiético e mais apropriadas para a expansão ex vivo. O suporte das CTMs foi crucial para a expansão ex vivo das CTPHs. As CTMs do vilo em P5 promoveram melhores taxas de expansão das CTPHs que as da MC em P1, em ambiente 2D e foram selecionadas para a expansão em ambiente 3D. A expansão das CTPHs com CTMs do vilo em ambiente 2D demonstrou melhores taxas de expansão que no ambiente 3D. Com base nos resultados conclui-se que a melhor condição para expansão ex vivo de CTPHs do SCUP, compreende a co-cultura de CTPHs oriundas de doações com idade gestacional acima de 39,5 semanas, contagens de CNT acima de 13,05 x 106 por mL, percentagem de NRBC igual ou maior de 2,875% e com contagem de células CD34+ superiores a 23,73 x 103 células por mL, em ambiente 2D e com suporte de CTMs do vilo em P5.<br>

Abstract : Umbilical cord blood (UCB) has been used as an alternative source of hematopoietic stem progenitor cells (HSPC) in HSPC transplantation to treat many hematological diseases. As a HSPC source, UCB has many practical advantages such as: easy procurement with no risks for donors and mothers, immediate availability if stored fully tested and human leucocyte antigen (HLA) typed, and a toleration of some degree of HLA mismatch. On the other hand, its major limitation is the low cell dose delivered. It is known that cell dose is the most important factor for engraftment. As a result, delayed neutrophil and platelet recovery are linked to UCB transplantation. Some strategies to overcome its main limitation include establishing criteria for the selection and storage units of UCB, transplanting more than one unit of UCB, and ex vivo expansion of CBHSPC (cord blood-derived hematopoietic stem progenitor cells). CBHSPC ex vivo expansion in 2D or 3D culture systems without cells from hematopoietic microenvironment deprived them of cell-to-cell contact and molecular interactions during hematopoiesis in vivo. This study is focused on ex vivo expansion of CBHSPC in a culture system with stromal support provided by MSC (mesenchymal stem cells) from human placental chorionic membrane (cMSC) and villi (vMSC). This approach includes cultures in 2D and 3D systems. The 3D cultures were performed on scaffold of cross-linked bovine collagen type I and chondroitin-6-sulfate. MSC morphology and phenotype (surface antigens CD73, CD90, CD105, CD34 and CD45) from both tissues were analyzed at three passages (P1, P5 and P10). In addition, real time PCR was performed to quantify gene expression of hematopoietic cytokines (SCF, Flt3-L, TPO, IL6, IL16 and SDF1) by MSC. Procedures in cord blood included CBC (complete blood count), CD34+ cells count and its subpopulations, CD34+ cell isolation, and clonogenic potential evaluation. Associations of maternal and fetal factors with UCB parameters and its clonogenic potential data as well as ex vivo expansion rates were addressed. cMSC from P1(cMSCP1) and vMSC from P5 (vMSCP5) were used in co-cultures for ex vivo expansion of CBHSPC. Results - cMSC and vMSC from all passages showed morphological and phenotypic features typically of MSC as well as expressed all hematopoietic cytokines evaluated in this study; cMSCP1 and vMSCP5 showed the best cytokines expression profile and were selected for further experiments. Analysis regarding associations among all results suggest that UCB from gestational age greater than 39,5 weeks, with nucleated cells count above 13,05 x 106 cells per mL, nucleated ed blood cells (NRBC) percentage greater than 2,875% and CD34+ cell counts greater than 23,73 x 103 cells per mL are the best UCB samples for ex vivo expansion and hematopoietic content. MSC presence was crucial for CBHSPC ex vivo expansion in both 2D and 3D cultures; vMSCP5 promoted greater expansion rates than cMSCP1 in 2D co-cultures. vMSCP5 was selected for 3D expansion cultures. When comparing expansion rates between 2D and 3D co-cultures (both with vMSCP5), 2D co-cultures promoted greater expansion rates than 3D cocultures.