O efeito de elevados níveis de homosisteína sobre a expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular e à diferenciação condrogênica no desenvolvimento dos membros

Abstract

Elevados níveis de homocisteína (Hcy) caracterizam a condição metabólica chamada de hiperhomocisteinemia, a qual é resultante da deficiência nutricional de ácido fólico (AF). Esta condição pode induzir danos ao DNA, parada do ciclo e alterações na diferenciação celular, devido à não-remetilação de Hcy para metionina. O objetivo deste estudo foi investigar se elevados níveis de Hcy interferem no processo de formação dos elementos cartilaginosos durante o desenvolvimento dos membros, especificamente na expressão de proteínas relacionadas ao ciclo celular e à diferenciação condrogênica. Para tal, embriões de Gallus domesticus foram tratados com dois dias de incubação (E2) com 20 µmol D-L Hcy/50 µL salina e analisados com seis dias de incubação (E6). Embriões do grupo controle foram tratados somente com 50 µL de solução de salina. Para identificar as células em proliferação, bem como as proteínas envolvidas no ciclo celular foram realizadas análises por imuno-histoquímica e citometria de fluxo, utilizando anticorpos anti-fosfohistona H3 (marcador mitótico), anti-p53, anti-p21 e anti-PCNA. Do mesmo modo, para identificar a diferenciação celular foram realizados imunolocalização e análises de citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-Pax1, anti-Pax9, anti-Sox9 e anti-VCAM-1. Análises complementares por citometria de fluxo foram realizadas para identificar as células apoptóticas utilizando os anticorpos anti-Bak e anti-Bcl2. Não foram observadas diferenças significativas na taxa de proliferação celular entre embriões controle e tratados com Hcy. Por outro lado, o tratamento com Hcy induziu a uma redução na expressão das proteínas PCNA e p21, as quais estão envolvidas no reparo do DNA e na progressão da fase G1 do ciclo celular, respectivamente. Além disso, o tratamento com Hcy também induziu nas células mesenquimais um aumento na expressão da proteína p53, bem como um aumento na expressão das proteínas Bak (pró-apoptótica) e Bcl2 (antiapoptótica). Para diferenciação celular, houve uma redução na expressão dos produtos gênicos de Pax1, Pax9 e Sox9 nos embriões tratados com Hcy. Por fim, a expressão da molécula de adesão vascular VCAM-1 foi reduzida após exposição a elevados níveis de Hcy. As alterações no ciclo, na diferenciação, bem como na molécula de adesão celular vascular observadas no presente estudo, podem estar relacionadas com as frequências de anomalias congênitas em membros, após exposição a elevados níveis de Hcy. <br>

Abstract : High homocysteine (Hcy) levels characterize the metabolic condition named hyperhomocysteinemia, which results from nutritional deficiency of folic acid (FA). This condition can induce DNA damage, cell cycle arrest and changes in differentiation, due to non-remethylation of the homocysteine to methionine. The aim of this study was to investigate whether high levels of Hcy interfer in the formation of the cartilaginous elements, during the limb development, focusing in the expression of proteins related to the cell cycle and chondrogenic differentiation. Thus, embryos of Gallus domesticus were treated at two days of incubation (E2) with 20 µmol DL Hcy/50 µL saline and analyzed at six days of incubation (E6). Control embryos were only treated with 50 µL saline. To identify the proliferating cells, as well as, the proteins involved in the cell cycle, immunohistochemistry and flow cytometry using antibodies anti-phosphohistone H3 (mitotic marker), anti-p53, anti-p21 and anti-PCNA were performed. Also, to identify the cell differentiation, immunolocalization and flow cytometry analyses using antibodies anti-Pax1, anti-Pax9, anti-Sox9 and anti-VCAM-1 were performed. Additional analyses by flow cytometry were conducted to identify the apoptotic cells using antibodies anti-Bak and anti-Bcl2. No significant differences on cell proliferation rate were observed between control and Hcy-treated embryos. On the other hand, Hcy-treatment induced a reduction of the expression of PCNA and p21 proteins, which are involved in DNA repair and in progression of G1 phase of cell cycle, respectively. Furthermore, Hcy treatment also induced an increase of the p53 protein expression, as well as an increase in the expression of proteins Bak (pro-apoptotic) and Bcl 2 (anti-apoptotic) in the mesenchymal cells. For cell differentiation there was a reduction in the expression of gene products of Pax1, Pax9, and Sox9 in Hcy-treated embryos. Finally, the expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) was reduced after exposure to high levels of Hcy. Changes in cell cycle, differentiation, as well as, in vascular cell adhesion molecule observed in this study may be related to the frequency of limb congenital anomalies, after exposure to high levels of Hcy.