Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos

Challenges in microbial production of succinic acid: extracellular matrix characterization and strain improvement strategies for enhanced yield

Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT

Challenges in microbial production of succinic acid: extracellular matrix characterization and strain improvement strategies for enhanced yield Pereira, Isabela de Oliveira Este trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias para melhorar a produção microbiana de ácido succínico por Actinobacillus succinogenes e caracterizar a composição e propriedades do material polimérico extracelular (EPS) e biofilme produzidos por essa bactéria. A pesquisa foi conduzida em duas frentes principais: (i) a caracterização estrutural, físico-química e biológica do EPS e do biofilme gerados durante a fermentação, e (ii) o melhoramento da cepa por meio de Evolução Adaptativa Laboratorial (ALE) e mutagênese química com etilmetanossulfonato (EMS) para aumentar a tolerância ao ácido succínico. A caracterização do EPS foi realizada com o uso de técnicas de espectroscopia (FTIR, Raman), difração de raios-X, calorimetria diferencial de varredura (DSC), análise termogravimétrica (TGA), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e cromatografia (HPLC). Os resultados demonstraram que o EPS é um novo biopolímero composto majoritariamente por ácido succínico (44%) e manose (41%), com características similares aos succinoglicanos, mas especificidades como alto teor ácido succínico e manose e estrutura cristalina, os quais conferem maior resistência mecânica, estabilidade térmica e como sistemas de entrega em biomateriais interativos. A solução de EPS apresentou comportamento Newtoniano e baixa viscosidade (4 mPa s-1). As imagens de MEV revelaram uma matriz biofilme densa e fibrilar, com elevada concentração de células aderidas. Foi desenvolvida e validada uma metodologia de quantificação de biomassa aderida baseada na correlação entre o teor proteico do biofilme e a concentração celular, que indicou 2,03 ± 0,28 g de células por 100 g de biofilme seco, valor equivalente ao predito pela equação obtida a partir do teor de proteína (2,21 g/100 g). Essa abordagem permitiu contornar o gargalo de subestimação da biomassa total em processos de fermentação succínica e se apresenta como uma ferramenta alternativa para avaliação da biomassa imobilizada. Na segunda etapa, a aplicação de ALE e mutagênese química gerou mutantes com maior velocidade específica de crescimento e tolerância ao ácido succínico em comparação à cepa parental. Entre os mutantes obtidos, a cepa LMQ2.5 apresentou o melhor desempenho, com aumento de 3,6 vezes na produção de ácido succínico sob estresse ácido, maior eficiência de conversão e redução de cerca de quatro vezes na formação de biofilme, o que favorece a recuperação do produto e simplifica o processo downstream. Os resultados obtidos neste estudo preencheram lacunas científicas e tecnológicas relevantes relacionadas à fermentação succínica por A. succinogenes, incluindo a caracterização inédita do exopolissacarídeo produzido pela bactéria, contribuindo para a compreensão estrutural e funcional da matriz extracelular e do biofilme formados durante a fermentação. A metodologia de quantificação de células aderidas desenvolvida permitiu estimar de forma precisa a biomassa imobilizada, corrigindo distorções na avaliação do processo. Além disso, o aprimoramento da cepa por ALE e mutagênese química resultou em um mutante com elevada tolerância ao ácido succínico, maior eficiência fermentativa e menor formação de biofilme, demonstrando a viabilidade de estratégias evolutivas não transgênicas para otimização de cepas industriais. Em conjunto, esses avanços oferecem bases experimentais e metodológicas para o aprimoramento de bioprocessos de produção de ácido succínico e para a exploração de novos biopolímeros microbianos de interesse tecnológico.; Abstract: This study aimed to develop strategies to improve the microbial production of succinic acid by Actinobacillus succinogenes and to characterize the composition and properties of the extracellular polymeric substance (EPS) and biofilm produced by this bacterium. The research was conducted in two main approaches: (i) the structural and physicochemical characterization of the EPS and biofilm generated during fermentation, and (ii) strain improvement through Adaptive Laboratory Evolution (ALE) and chemical mutagenesis using EMS to increase tolerance to succinic acid. Characterization of the extracellular material was performed using spectroscopic techniques (FTIR, Raman), X-ray diffraction (XRD), differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (SEM), and chromatography (HPLC). The results demonstrated that the EPS is a novel biopolymer composed mainly of succinic acid (44%) and mannose (41%), exhibiting similarities to succinoglycans but with unique characteristics such as a high acid content and crystalline structure. The aqueous EPS solution showed Newtonian behavior and low viscosity (4 mPa·s?¹), as well as good thermal stability. SEM images revealed a dense and fibrillar biofilm matrix with a high amount of adhered cells. A methodology was developed and validated to quantify adhered biomass based on the correlation between the protein content of the biofilm and the cell concentration, indicating 2.03 ± 0.28 g of cells per 100 g of dry biofilm ? a value equivalent to that predicted by the protein-based equation (2.21 g/100 g). This approach confirmed the underestimation of total biomass in conventional fermentation analyses and provides an alternative tool for assessing immobilized biomass in biofilm-forming systems. In the second part of the study, the application of ALE and chemical mutagenesis generated mutants with higher specific growth rates and greater tolerance to succinic acid compared with the parental strain. Among the obtained mutants, strain LMQ2.5 exhibited the best performance, with a 3.6-fold increase in succinic acid production under acid stress, higher conversion efficiency, and approximately fourfold reduction in biofilm formation, favoring product recovery and simplifying downstream processing. The results of this study addressed key scientific and technological gaps related to the physiology and behavior of A. succinogenes in fermentative systems. The first-time characterization of the exopolysaccharide secreted by this bacterium revealed a new succinic and mannose-rich biopolymer, contributing to the understanding of the structural and functional composition of the extracellular matrix and biofilm formed during fermentation. The developed methodology for quantifying adhered cells enabled accurate estimation of immobilized biomass, correcting kinetic evaluation distortions and strengthening growth analyses in biofilm systems. Furthermore, strain improvement by ALE and EMS mutagenesis resulted in a mutant with high succinic acid tolerance, enhanced fermentation performance, and reduced biofilm formation, demonstrating the feasibility of non-recombinant evolutionary strategies for industrial strain optimization. Together, these advances provide experimental and methodological foundations for the improvement of succinic acid bioprocesses and the exploration of new microbial biopolymers of technological relevance. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2026.

Equilíbrio de fases a altas pressões e considerações sobre a formação de sistemas contendo dióxido de carbono e deep eutectic solvent (mentol + eucaliptol): estudo experimental e modelagem

Thu, 01 Jan 2026 00:00:00 GMT

Equilíbrio de fases a altas pressões e considerações sobre a formação de sistemas contendo dióxido de carbono e deep eutectic solvent (mentol + eucaliptol): estudo experimental e modelagem Mota, Felipe Gois A combinação do Deep eutectic solvent (DES) à base de mentol e eucaliptol com a tecnologia supercrítica é uma área ainda pouco explorada, sendo de suma importância o conhecimento do equilíbrio de fases e das propriedades termofísicas sob diferentes condições de pressão, temperatura e composição para a determinação das condições operacionais necessárias sob alta pressão. Determinou-se o equilíbrio de fases de misturas envolvendo os sistemas binários contendo dióxido de carbono (CO2) (1) + L-mentol (2), CO2 (1) + eucaliptol (2) e CO2 (1) + DES Men:Eu (2) e o sistema ternário contendo CO2 (1) + eucaliptol (2) + L-mentol (3). Empregou-se o método visual sintético com as razões molares de CO2 variando de 0,60 a 0,99 nas temperaturas de 313,15, 323,15 e 333,15 K. Para o sistema CO2 + L-mentol, o equilíbrio líquido-vapor (ELV), com as transições como o ponto de bolha (PB) e ponto de orvalho (PO), foi observado na faixa de pressão de 6,87 a 17,88 MPa. No sistema CO2 + eucaliptol, as mesmas transições (ELV-PB e ELV-PO) foram observadas entre 5,31 e 11,76 MPa. Considerando o sistema CO2 + DES Men:Eu, visualizou-se o ELV com o PB e PO, além do equilíbrio líquido-líquido (ELL) e equilíbrio líquido-líquido-vapor (ELLV) entre 6,19 e 14,08 MPa. Já para o sistema ternário CO2 + eucaliptol + L-mentol, essas mesmas transições (ELV-PB, ELV-PO, ELL e ELLV) foram visualizadas entre 6,33 e 14,38 MPa. Ambos os sistemas exibiram o comportamento Lower Critical Solution Temperature (LCST), por meio do aumento das pressões de transição com o aumento da temperatura. Por fim, a equação de estado de Peng-Robinson com as regras de mistura de van der Waals (PR_vdW) e Wong-Sandler (PR_WS) foi utilizada para correlacionar os dados obtidos experimentalmente, representando de forma satisfatória os dados de equilíbrio de fases, com os desvios menores que 0,304 MPa. Logo, os resultados obtidos fornecem uma base para futuros estudos sobre o uso do DES de L-mentol e eucaliptol em altas pressões, uma vez que ainda são escassos os dados de equilíbrio de fases disponíveis na literatura científica para os sistemas investigados neste trabalho.; Abstract: The combination of Deep Eutectic Solvent (DES) based on menthol and eucalyptol with supercritical technology is a still little explored area, and knowledge of phase equilibrium and thermophysical properties under different pressure, temperature and composition conditions is of paramount importance for determining the operating conditions under high pressure. The phase equilibrium of mixtures involving binary systems containing carbon dioxide (CO2) (1) + L-menthol (2), CO2 (1) + eucalyptol (2) and CO2 (1) + DES Men:Eu (2) and the ternary system containing CO2 (1) + eucalyptol (2) + L-menthol (3) is determined. The synthetic visual method was employed with CO2 molar ratios varying from 0.60 to 0.99 at temperatures of 313.15, 323.15, and 333.15 K. For the CO2 + L-menthol system, vapor-liquid equilibrium (VLE), with transitions such as the bubble point (BP) and dew point (DP), was observed in the pressure range of 6.87 to 17.88 MPa. In the CO2 + eucalyptol system, the same transitions (VLE-BP and VLE-DP) were observed between 5.31 and 11.76 MPa. Considering the CO2 + DES Men:Eu system, VLE with BP and DP, as well as liquid-liquid equilibrium (LLE) and liquid-liquid-vapor equilibrium (VLLE), were visualized between 6.19 and 14.08 MPa. For the ternary system CO2 + eucalyptol + L-menthol, these same transitions (VLW-BP, VLE-DP, LLE, and VLLE) were observed between 6.33 and 14.38 MPa. Both systems exhibited Lower Critical Solution Temperature (LCST) behavior, with increasing transition pressures and increasing temperature. Finally, Peng-Robinson state finding with van der Waals (PR_vdW) and Wong-Sandler (PR_WS) mixing rules was used to correlate the experimentally obtained data, satisfactorily representing the phase equilibrium data, with deviations smaller than 0.304 MPa. Therefore, the results obtained provide a basis for future studies on the use of L-menthol and eucalyptol DES at high pressures, since phase equilibrium data for the systems investigated in this work are still scarce in the scientific literature. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2026.

Equilíbrio de fases e síntese enzimática de éster de açúcar em CO2 supercrítico

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

Equilíbrio de fases e síntese enzimática de éster de açúcar em CO2 supercrítico Barros, Eulália Lopes da Silva Esta tese aborda a síntese de ésteres de açúcar por meio de esterificação enzimática entre glicose e ácido láurico, com ênfase na aplicação de tecnologia supercrítica e no uso do solvente alternativo 2-metiltetra-hidrofuran-3-ona (MeTHF-3-ona). A tecnologia supercrítica mostrou-se altamente promissora para otimizar a eficiência e sustentabilidade do processo, permitindo controle refinado das condições reacionais. Estudos de equilíbrio de fases foram essenciais para caracterizar os sistemas binários e ternários de CO2, MeTHF-3-ona, glicose e ácido láurico, destacando o efeito antissolvente do CO2 sobre a glicose e a eficácia da MeTHF-3-ona como cosolvente, aumentando a solubilidade do ácido láurico e viabilizando a esterificação. As análises por FTIR e RMN confirmaram a formação do éster de açúcar a/ß-D-glicose-6-O-laurato, evidenciando a eficiência da reação. Embora a MeTHF-3-ona mostre ser uma alternativa promissora e sustentável aos solventes convencionais, mais estudos são necessários para validar integralmente suas vantagens. Assim, a integração de fluidos supercríticos e o uso de solventes verdes despontam como estratégias promissoras para a produção sustentável de ésteres de açúcar, com potencial de aplicação na indústria alimentícia e em outros setores, promovendo o desenvolvimento de processos químicos mais eficientes e ecologicamente responsáveis, especialmente na criação de surfactantes de base biológica.; Abstract: This thesis addresses the synthesis of sugar esters by enzymatic esterification between glucose and lauric acid, with emphasis on the application of supercritical technology and the use of the alternative solvent 2-methyltetrahydrofuran-3-one (MeTHF-3-one). Supercritical technology has shown great promise for optimizing process efficiency and sustainability, allowing refined control of reaction conditions. Phase equilibrium studies were essential to characterize the binary and ternary systems of CO2, MeTHF-3-one, glucose, and lauric acid, highlighting the antisolvent effect of CO2 on glucose and the effectiveness of MeTHF-3-one as a cosolvent, increasing the solubility of lauric acid, and enabling esterification. FTIR and NMR analyses confirmed the formation of the sugar ester a/ß-D-glucose-6-O-laurate, evidencing the efficiency of the reaction. Although MeTHF-3-one is a promising and sustainable alternative to conventional solvents, further studies are needed to validate its advantages fully. Thus, the integration of supercritical fluids and the use of green solvents emerge as promising strategies for the sustainable production of sugar esters, with potential for application in the food industry and other sectors, promoting the development of more efficient and environmentally responsible chemical processes, especially in the creation of bio-based surfactants. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2024.

Valorização da polpa de guabiroba (campomanesia xanthocarpa O.Berg) visando o desenvolvimento e a caracterização de produtos lácteos funcionais

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

Valorização da polpa de guabiroba (campomanesia xanthocarpa O.Berg) visando o desenvolvimento e a caracterização de produtos lácteos funcionais Mindelo, Leandro José de Oliveira A pesquisa avaliou a adição de diferentes concentrações de polpa de guabiroba (Campomanesia xanthocarpa O. Berg) em Doce de leite (5, 10, 15, 20, 25 e 30%) e Queijo fresco (5, 10 e 15%). O uso da polpa foi pensado para maximizar estudos a partir de um fruto silvestre e o seu potencial mercadológico como um produto lácteo inovador com boas características nutricionais e funcionais. No doce de leite, analisou-se as propriedades físicoquímicas, cor (a*), capacidade antioxidante, compostos fenólicos totais e carotenoides. Já para o queijo, foram avaliadas características físico-químicas, cor, textura, capacidade antioxidante, perfil multielementar e capacidade antimicrobiana. No doce de leite, a adição da polpa não alterou os níveis de proteína, mas 5% (polpa) apresentou aumento de 123% em relação ao mínimo estabelecido. Todas as formulações com polpa registraram redução do pH, umidade e sólidos solúveis totais (p < 0,05), além do aumento no parâmetro de cor a*, conferindo tonalidade alaranjada. A capacidade antioxidante, medida pelo DPPH, mostrou que as amostras com 15 a 30% não diferiram (p > 0,05), com valores entre 283,18 e 360,38 mg TEAC/100g. O teor de compostos fenólicos totais aumentou em 49,62% na formulação com 30% de polpa. A polpa aumentou a concentração de a-caroteno, ß-caroteno, ß-criptoxantina e ?-caroteno, sendo o ß-caroteno o de maior concentração, até 6,67 vezes superior à amostra controle. No Queijo fresco, a adição de polpa resultou na diminuição da capacidade de água, cinzas, pH e acidez titulável. A coloração apresentou alteração visível e tendência ao amarelo-avermelhado. Houve redução da firmeza, elasticidade e gomosidade. O teor de compostos fenólicos totais aumentou entre 1,4 e 2,5 vezes nas formulações com 10 e 15% de polpa. A capacidade antioxidante in vitro cresceu de forma significativa (p < 0,05), com aumentos de 220, 238 e 268% (DPPH) e 13, 28 e 48% (ABTS). O teor de carotenoides aumentou em todas as formulações com polpa, destacando-se o ß-caroteno. A lactose não foi afetada (p > 0,05), mas a formulação com 15% de polpa apresentou redução nos níveis de galactose, sem alteração significativa (p > 0,05) nos teores de glicose, sacarose e frutose. A adição da polpa elevou os níveis de compostos hidrofílicos e lipofílicos, identificando-se ácidos orgânicos, aminoácidos e açúcares ácidos. No perfil multielementar, os principais elementos encontrados foram Ca > P > S > K > Mg > Zn > Sr, sem a presença de elementos tóxicos. Quanto à capacidade antimicrobiana, as amostras com 5, 10 e 15% de polpa apresentaram redução de 98, 97 e 96% na contagem de Staphylococcus aureus e de 21, 0 e 33% para Escherichia coli, respectivamente. Os resultados indicam que a adição de polpa de guabiroba pode melhorar a qualidade nutricional e funcional dos produtos lácteos, além de oferecer propriedades antimicrobianas. O uso da polpa representa uma alternativa viável para a indústria de laticínios, promovendo a diversificação da produção e explorando matérias-primas pouco utilizadas. A inclusão desse fruto silvestre, rico em compostos bioativos, amplia o conhecimento sobre ingredientes funcionais e seus benefícios para a saúde.; Abstract: The study evaluated the addition of different concentrations of guabiroba pulp (Campomanesia xanthocarpa O. Berg) in Dulce de leche (5, 10, 15, 20, 25, and 30%) and fresh cheese (5, 10, and 15%). The use of the pulp was intended to maximize studies on a wild fruit and its market potential as an innovative dairy product with good nutritional and functional characteristics. In Dulce de leche, the physicochemical properties, color (a*), antioxidant capacity, total phenolic compounds, and carotenoids were analyzed. For the cheese, physicochemical characteristics, color, texture, antioxidant capacity, multielemental profile, and antimicrobial capacity were evaluated. In Dulce de leche, the addition of the pulp did not alter protein levels, but the 5% (pulp) formulation showed a 123% increase compared to the minimum established. All pulp-added formulations recorded a reduction in pH, moisture, and total soluble solids (p < 0.05), along with an increase in the color parameter a*, giving an orange hue. The antioxidant capacity, measured by DPPH, showed that samples with 15 to 30% did not differ (p > 0.05), with values between 283.18 and 360.38 mg TEAC/100g. The total phenolic content increased by 49.62% in the 30% pulp formulation. The pulp increased the concentration of a-carotene, ß-carotene, ß-cryptoxanthin, and ?-carotene, with ß-carotene being the most concentrated?up to 6.67 times higher than the control sample. In fresh cheese, the addition of pulp resulted in reduced water-holding capacity, ash content, pH, and titratable acidity. The color showed visible changes and a tendency toward a yellowish-reddish hue. There was a reduction in firmness, elasticity, and gumminess. The total phenolic content increased between 1.4 and 2.5 times in formulations with 10% and 15% pulp. The in vitro antioxidant capacity increased significantly (p < 0.05), with rises of 220%, 238%, and 268% (DPPH) and 13%, 28%, and 48% (ABTS). Carotenoid content increased in all pulp-added formulations, with ß-carotene standing out. Lactose was not affected (p > 0.05), but the 15% pulp formulation showed reduced galactose levels, with no significant change (p > 0.05) in glucose, sucrose, and fructose content. The addition of pulp increased the levels of hydrophilic and lipophilic compounds, identifying organic acids, amino acids, and acidic sugars. In the multielemental profile, the main elements found were Ca > P > S > K > Mg > Zn > Sr, with no presence of toxic elements. Regarding antimicrobial capacity, samples with 5%, 10%, and 15% pulp showed reductions of 98%, 97%, and 96% in Staphylococcus aureus counts and 21%, 0%, and 33% for Escherichia coli, respectively. The results indicate that adding guabiroba pulp can improve the nutritional and functional quality of dairy products while also providing antimicrobial properties. The use of the pulp represents a viable alternative for the dairy industry, promoting production diversification and exploring underutilized raw materials. The inclusion of this wild fruit, rich in bioactive compounds, expands knowledge about functional ingredients and their consumption benefits. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2025.