O papel da microglia nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela exposição precoce ao mimético viral Poly I:C em modelos in vivo e in vitro

Abstract

A exposição a desafios imunológicos durante janelas críticas do desenvolvimento pode impactar negativamente a maturação do sistema nervoso central e aumentar a vulnerabilidade a transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Neste contexto, a microglia é um elemento-chave na mediação das respostas neuroimunes, atuando tanto na modulação da neuroinflamação quanto na manutenção da plasticidade sináptica. Este trabalho investigou o papel da microglia nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração pré-pubertal do mimético viral Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C) em camundongos, bem como os efeitos diretos desse composto sobre a viabilidade, metabolismo e ativação microglial in vitro. No modelo in vivo, camundongos C57BL/6 machos e fêmeas receberam Poly I:C (10 mg/kg, i.p.) entre os dias pós-natais (DPN) 22 e 26. Ambos os sexos apresentaram redução transiente no ganho de peso e sinais de comportamento doente, visto pela redução da distância e velocidade média percorrida no teste do campo aberto. No DPN 27, apenas os machos demonstraram hipolocomoção e comportamento tipo-ansioso no teste do labirinto em cruz elevado. Contudo, na idade adulta (DPN 60), apenas as fêmeas apresentaram alterações comportamentais, caracterizadas por hiperlocomoção e comportamento tipo-ansioso. A avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) por extravasamento de fluoresceína de sódio revelou um aumento de permeabilidade precoce no hipocampo e córtex pré-frontal de fêmeas, mas não de machos (24h após o fim do estímulo). A dosagem de citocinas por ELISA no córtex pré-frontal e hipocampo dos animais adultos não indicou alteração nos níveis de IL-1ß, TNF-a, IL-10; no entanto, observou-se redução de TNF-a no córtex pré-frontal das fêmeas adultas tratadas com Poly I:C no início do período pós-natal. A análise por Western blot demonstrou aumento nos níveis de PSD95 e SNAP25, além de redução do conteúdo do marcador microglial Iba-1 no córtex pré-frontal de fêmeas adultas expostas ao Poly I:C precoce, sem alterações significativas em outras proteínas sinápticas ou em outras proteínas relacionadas à neuroplasticidade, à atividade microglial e à neuroinflamação (gefirina, sinapsina 1, GluA1, CD68, CD300f, TREM2, CX3CR1, P2XR7, P2YR12, A1R and A2AR). Por outro lado, a análise morfológica por imunofluorescência para Iba-1 revelou ausência de alterações significativas na densidade, área, perímetro, circularidade ou ramificação da microglia no córtex pré-frontal de ambos os sexos na idade adulta, sugerindo que a exposição pré-púbere ao Poly I:C não promove disfunção morfológica microglial de longo prazo. No modelo in vitro, células BV2, uma linhagem de células microgliais murinas, foram tratadas com diferentes concentrações de Poly I:C (5?100 µg/ml) por 24 horas, seguidas ou não por estimulação com padrão molecular associado à dano, ATP (500 µM, 2 h). O Poly I:C aumentou a viabilidade celular e reduziu a liberação de LDH, enquanto induziu acúmulo de nitrito apenas em concentrações elevadas, indicando possível proliferação acentuada e ativação microglial parcial. Embora a análise por espectroscopia de RMN com glicose [U-¹³C] não tenha revelado alterações metabólicas marcantes induzidas pelo Poly I:C, foram observadas adaptações sutis, especialmente nas vias glicolítica e anapleróticas. As duas concentrações testadas pareceram modular de maneira distinta o metabolismo das células BV2. O ATP isoladamente produziu efeitos semelhantes aos de doses baixas de Poly I:C, mas a combinação dos estímulos não resultou em resposta sinérgica. Em conjunto, os dados demonstram: 1) que a ativação imune precoce pelo Poly I:C induz algumas alterações duradouras e sexo-dependentes no comportamento e na plasticidade sináptica, sem promover neuroinflamação ou remodelamento morfológico e metabólico microglial pronunciados em camundongos. 2) que o Poly I:C promove em células microgliais adaptações metabólicas e funcionais dependentes da concentração. Esses achados destacam a importância da janela de desenvolvimento, do sexo biológico e da função microglial na vulnerabilidade aos efeitos de desafios imunológicos precoces.

Abstract: Exposure to immune challenges during critical windows of development can negatively impact the maturation of the central nervous system and increase vulnerability to neuropsychiatric and neurodegenerative disorders. In this context, microglia play a key role in mediating neuroimmune responses, acting both in the modulation of neuroinflammation and in the maintenance of synaptic plasticity. This study investigated the role of microglia in behavioral and neurochemical alterations induced by prepubertal administration of the viral mimetic Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C) in mice, as well as the direct effects of this compound on microglial viability, metabolism, and activation in vitro. In the in vivo model, male and female C57BL/6 mice received Poly I:C (10 mg/kg, i.p.) from postnatal day (PND) 22 to 26. Both sexes exhibited transient reductions in weight gain and signs of sickness behavior, as evidenced by decreased total distance and average velocity in the open field test. On PND 27, only males showed hypolocomotion and anxiety-like behavior in the elevated plus maze. However, in adulthood (PND 60), only females presented behavioral changes, characterized by hyperlocomotion and anxiety-like behavior. Assessment of blood?brain barrier (BBB) permeability using sodium fluorescein extravasation revealed early increased permeability in the hippocampus and prefrontal cortex of females, but not males (24h after the last injection). ELISA-based quantification of cytokines in the prefrontal cortex and hippocampus of adult animals did not show changes in IL-1ß, TNF-a, or IL-10 levels; however, a reduction in TNF-a was observed in the prefrontal cortex of adult females treated with early-life Poly I:C. Western blot analysis revealed increased levels of PSD95 and SNAP25, along with reduced expression of the microglial marker Iba-1 in the prefrontal cortex of adult females exposed to Poly I:C, without significant changes in other synaptic or neuroplasticity-related proteins, microglial markers, or inflammation-related proteins (gephyrin, synapsin-1, GluA1, CD68, CD300f, TREM2, CX3CR1, P2XR7, P2YR12, A1R and A2AR). On the other hand, Iba-1 immunofluorescence-based morphological analysis showed no significant changes in microglial density, area, perimeter, circularity, or branching in the prefrontal cortex of either sex in adulthood, suggesting that prepubertal exposure to Poly I:C does not promote long-term morphological microglial dysfunction. In the in vitro model, BV2 cells?a murine microglial cell line?were treated with different concentrations of Poly I:C (5?100 µg/ml) for 24 hours, followed or not by stimulation with the damage-associated molecular pattern (DAMP) ATP (500 µM, 2 h). Poly I:C increased cell viability and reduced LDH release, while nitrite accumulation was observed only at higher concentrations, suggesting enhanced proliferation and partial microglial activation. Although [U-¹³C]-glucose NMR spectroscopy did not reveal major metabolic changes induced by Poly I:C, subtle adaptations were observed, particularly in glycolytic and anaplerotic pathways. The two tested concentrations appeared to modulate BV2 metabolism in distinct ways. ATP alone produced effects similar to low-dose Poly I:C, but the combination of stimuli did not result in a synergistic response. Together, the data demonstrate: 1) that early immune activation by Poly I:C induces some lasting and sex-dependent changes in behavior and synaptic plasticity, without eliciting pronounced neuroinflammation or morphological and metabolic remodeling of microglia in mice; and 2) that Poly I:C promotes concentration-dependent metabolic and functional adaptations in microglial cells. These findings highlight the importance of the developmental window, biological sex, and microglial function in vulnerability to the effects of early immune challenges.